[发明专利]一种基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，涉及一种基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法。

背景技术

随着分子生物学的快速发展，分子遗传标记技术已广泛应用于分子遗传图谱的构建，遗传多样性分析，医学诊断等方面，包括扩增片段长度多态性标记（Amplified restriction fragment polymorphisms，AFLPs），简单重复序列标记（simple sequence repeats，SSRs），单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphisms，SNPs）等。在这些分子标记中，SSR标记又称为微卫星标记（microsatellites），是由1-6个核苷酸经过多次重复组成的串联重复序列，重复序列两端有保守序列，可以根据两端的保守序列设计引物，即SSR引物，进行PCR扩增，不同基因型的材料重复序列长度不同，可以作为多态性分析。由于SSR广泛的分布在基因组中，多态性丰富，重复性好，数据易于统计，共显性遗传等优点，越来越广泛应用。然而，不像AFLPs，SNPs等分子标记，SSR分子标记具有物种特异性，需要对每一个物种单独开发。

目前广泛使用的是磁珠富集法开发SSR标记（Mol Ecol2002,11,1），在传统的磁珠富集法中，先提取基因组DNA，酶切成200-800bp的片段，加接头进行PCR扩增，然后将含有SSR的片段和生物素化的微卫星探针杂交，再与链霉亲和素修饰的磁珠结合。形成DNA-探针-磁珠复合物。在外磁场的作用下，通过多次洗涤将非特异性的DNA去除，DNA与探针-磁珠复合物进行分离，得到含有SSR序列的特异性片段。传统的磁珠富集法在eppendorf管中进行，要消耗大量的试剂和磁珠，磁珠一般价格较贵，而且需要复杂繁琐的人工洗涤、吹打过程。长时间的洗涤会引起大量的材料丢失，得到的含有SSR序列的片段少，导致筛选失败；而不充分的洗涤会引起出现大量的非特异性DNA，会得到很多假阳性的序列，这个分离过程对筛选SSR标记非常重要，而且需要熟练的操作人员。

微流控芯片技术，是近年来发展的一个新的研究领域，通过把生物、医学、化学等样本的反应、分离、检测等过程集成到微米级大小的芯片上，需要少量的样本和试剂，而且可以快速分离得到高纯度的分子物质，自动完成整个过程。最近，微流控芯片技术已经应用在生物和医学检测很多方面，包括荧光原位杂交定位序列在细胞核的分布情况，染色质免疫共沉淀检测染色质的表观修饰情况以及配体的筛选等（Microsystems and Nanotechnology:Springer,2012,853-895）。因此如果能将微流控芯片技术应用于传统筛选SSR标记的FIASCO方法中，将避免上述的缺点，减少试剂的用量和操作时间，不需要熟练的操作人员，并且由于在芯片中可以充分洗涤又不会有样本损失，可以实现SSR标记的快速筛选。然而如何在微流控芯片进行精确地磁场控制，使得在高流速情况下快速捕获磁珠和高流速下清洗过程，是进行特异性SSR标记快速筛选的首要条件。通过现有技术检索，中国专利授权号201010196067.9公开的“一种微磁场控制的微流控芯片及其制作方法”，该方法制作的微流控芯片可以在微米范围内进行磁场控制，在高流速下能够捕获磁性物质，因此结合磁场可控微流控芯片，开发一种快速筛选SSR标记的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法，该方法操作简单、方便易行。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法，包括如下步骤：提取基因组DNA，将基因组DNA酶切成200-800bp的片段；往酶切片段两端加接头进行PCR扩增，将PCR扩增产物和微卫星探针杂交；制备可以与微卫星探针结合的磁珠；制备磁场可控的微流控芯片；使用阀门和Matlab软件控制溶液从微流控芯片中进入和流出，将磁珠、杂交混合物、洗脱液分别注入微流控芯片中，杂交混合物与磁珠结合，通过外磁场的作用，将杂交混合物与磁珠固定在微流控芯片中，洗脱液将杂质洗脱出来，通过加热使DNA变性，将含有SSR片段的DNA分离出来。