[发明专利]一种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法

权利要求书

1.一种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、DNA提取

B.引物设计及合成

根据RACE技术扩增得到的cDNA全长，利用Primer5.0设计启动子下游的特异性引物，引物序列交由上海生物工程有限公司合成：

特异性引物WK-1：AAGAGGAGTCCAAAGGTCACGGCAG

WK-2：TGAGATACCGGCCGTGCAGTAGACA

WK-3：CAGTAGACAAGGGCAAAGATCATACC

通用引物由上海英潍捷基贸易有限公司引物合成，

通用引物adapter-long：GTAA TACG ACTC ACTA TAGG GCAC GCGT GGTC GACG GCCC GGGC TGGT

adapter-short：ACCAGCCC

AP1：GTAATACGACTCACTATAGGGC

AP2：ACTATAGGGCACGCGTGGT；

C.接头处理

由英潍捷基合成的接头adapter-long和adapter-short分别稀释成100μmol/L，混合，95℃变性5分钟，慢慢冷却至室温，-20℃保存；

D.酶切

使用DraI、Stu I、Eco V和Pvu II酶切基因组DNA，电泳检测，最后用24：1的氯仿：异戊醇抽提后回收，反应体系为：5μl的100ng/μl基因组DNA，1μl的内切酶，2μl的10Xbuffer，加ddH₂O至总体积为20μl；

E.将接头与酶切片段连接

10μl的酶切DNA，2μl的50μM接头，2μl的10Xbuffer，1μl的T4DNA连接酶，加ddH₂O至总体积为20μl，16℃连接过夜；

F.PCR扩增

以AP1和WK1为引物进行第一轮PCR，以第一轮PCR产物为模板以AP2和WK3为引物进行巢式PCR扩增：

F1在0.2ml离心管中配制下列反应液：

1.0μl的连接产物，2.0μl的10×Ex Taq Buffer：Mg²⁺Plus，1.6μl的dNTP Mixture各2.5mM，0.4μl的引物1：10μM，0.4μl的引物2：10μM，0.2μl的TaKaRa Ex Taq：5U/μL，up to20μl的ddH₂O；

F2充分混匀，短暂离心：

设定PCR仪，反应条件如下：94℃，3min；94℃30sec，72℃3min，循环10次；94℃30sec，67℃3min，循环25次；72℃10min，4℃保存；

G.特异片段回收

步骤如下：

G1通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将目的片段DNA琼脂糖凝胶切下，放入1.5ml离心管中；

G2根据胶块的重量和浓度，加400μl的Buffer B2；

G3将离心管置于50℃水浴5-10min，间混匀，直至完全溶化；

G4目的片段小于500bp，加入Buffer B2体积1/3的异丙醇，混匀；

G5将融化好的溶液吸入吸附柱，8000g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

G6向吸附柱加入500μl Wash solution，9000g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

G7重复步骤G6一次；

G8将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min；

G9往吸附膜中央加入20μl Elution buffer，室温静置1-2min，9000g离心1min，将所得到的DNA溶液放入-20℃保存或用于后续试验；

H.回收产物与PMD18-T载体的连接

在PCR管中，用T-Vector与特异性片段进行连接，操作步骤如下：

H1加载体PMD18-T1μl；

H2加目的DNA片段1-4μl；

H3加Solution I缓冲液5μl；

H4加水至10μl；

H5在16℃下连接8小时以上；

I.质粒转化

I1感受态细胞冰上溶化5分钟，加入待转化的连接液或者质粒，冰上静置30min后；

I242℃水浴热击60s，冰上冷却1-2min；

I3加入800μlLB培养基，200rpm、37℃振荡培养1h；

I4取100μl涂板，37℃倒置培养14-16h后挑取单菌落摇菌；

I5菌液PCR；

J.序列测定及分析

将通过鉴定后，明确已插入目的片段的0.5ml菌液于1.5ml的离心管中，送上海生工测序；

测定的序列用DNAMAN，BLAST软件搜索GenBank/NCBI/RGP中的同源序列进行比较分析。

2.根据权利要求1所述的克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法，其特征在于，步骤A中DNA提取的步骤为：

A1称取0.5g新鲜嫩芽，在液氮中迅速研磨，至白色粉末状；

A2将粉末转入10ml离心管中，加入3ml65℃预热的pH8.0的CTAB提取液，包括：2％CTAB，1.4M NaCl，0.02M EDTA，0.1M Tris-HCl和2％PVP，30μLβ-琉基乙醇，摇匀后65℃温浴40min，不时摇动；

A3加入3ml的24：1的氯仿：异戊醇混合液，混匀后，室温12000rpm离心lO min；

A4取上清液于10ml离心管中，重复步骤A3两次；

A5取上清液于2ml离心管中，加入2ml预冷的异丙醇，缓慢充分混匀，-20℃静置1h；

A6用玻璃钩捞出沉淀，转入1.5ml离心管，加入70％的乙醇漂洗2-3次；

A7弃乙醇，风干DNA沉淀，用600μl TE缓冲液或ddH2O溶解，加入3μl10mg/ml RNase，混匀，37℃温浴30min；-20℃保存备用。