[发明专利]一种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法。

背景技术

山核桃(Carya cathayensis Sarg.)为胡桃科山核桃属，山核桃油味清香，营养丰富，是优良的食用油，是我国特有的名优干果和木本油料植物，具有很高的经济价值。山核桃主要分布于浙、皖两省交界的天目山区周围，地处北纬29°-31°，东经118°-120°，包括浙江临安、淳安、安吉、建国和安徽宁国、歙县、旌得、绩溪等县市。山核桃是浙西北山区农民脱贫致富，走向富裕的重要经济支柱，是一种重要的生态经济林树种。

但山核桃存在营养生长时间长，且树体高大，不易采摘，良种化和园艺化推广困难，形成了山核桃产业发展的一个巨大的瓶颈。植物嫁接作为植物无性繁殖中的一项重要园艺技术，是解决山核桃良种化和园艺化栽培的重要手段。黄坚钦等(2001)对山核桃嫁接成活进行了解剖学观察，确定了山核桃嫁接经过了愈伤组织形成、对接、维管束桥的形成及维管分化等过程。郑炳松等(2002)对山核桃嫁接成活的生理生化特性进行了分析，研究表明砧、穗含水量、蛋白质含量、可溶性糖含量等生理生化因子变化对山核桃嫁接成活有显著的影响嫁接作为植物无性繁殖中的一项重要园艺技术，是解决山核桃良种化和园艺化栽培的重要手段。

作为主要内在蛋白(membrane intrinsic protein，MIP)大家族的成员之一，水通道蛋白有利于水分和其它小分子物质如过氧化氢等的跨膜运输，参与了植物水分的长距离运输、细胞渗透平衡的调控以及气孔的关闭，器官的运动，种子萌发等生长发育过程。根据AQP的定位及序列同源性和结构特征，目前通常将植物AQPs分为五类：位于质膜上的质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins，PIPs)，又可分为PIP1、2二个亚类；位于液泡膜上的液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins，TIPs)，又分为α、β、γ、δ和ε-TIP五个亚类；存在于共生根瘤类菌体周围膜上的类Nod26膜内在蛋白(nodulin26-like intrinsic proteins，NIPs)；小分子碱性膜内在蛋白(small and basic intrinsic proteins，SIPs)，分为SIP1和SIP2二个亚类；类GlpF(glycerol facilitator)膜内在蛋白(GlpF-like intrinsic proteins，GIPs)。球蒴藓基因组中除具有PIPs、TIPs、NIPs、SIPs和GIPs五类AQP外，还具有HIP(hybrid intrinsic proteins)和XIPs(X intrinsic proteins)两个新类别。

水是植物细胞的重要组成成分，植物水通道蛋白是细胞间和细胞内水分快速运输的主要通道，作为植物水通道蛋白的一个亚类，质膜内在蛋白分为PIP1和PIP2两个亚类PIPs定位于原生质膜上，所有的PIPs均高度保守，与植物种类无关。孔道狭窄，为典型的高水分选择性通道蛋白。在所有已知的高等植物PIPs中，存在两个高度保守的区域：GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VFWF/YN，分别位于C环和E环，可能与PIPs功能的特异性有关。PIPs分为PIP1和PIP2两个亚类，两者的区别在N-端和C-端的不同。PIP1比PIP2具较长的N-端和较短的C-端，而且在序列当中各有相应的保守氨基酸。

现有技术中采用常规PCR技术：是基于全序列已知的基因。具体见：李姗姗，迟彦，李凌飞，等.启动子克隆方法研究进展[J].中国生物工程杂志，2005，25(7)：9-16。现有技术中采用PCR技术：是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR，从而获得完整的启动子的方法。存在以下缺陷：1)PCR过程中容易产生DNA环化，导致非特异扩增，造成扩增效率差，经常得不到满意的结果；2)酶切片段太长也会使扩增效率下降，试验成本高；3)工作量大，实验技术要求高。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种节约成本、简便易行的克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法。其技术方案如下：

一种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法，包括以下步骤：

A、DNA提取

B、引物设计及合成

根据RACE技术扩增得到的eDNA全长，利用Primer5.0设计启动子下游的特异性引物，引物序列交由上海生物工程有限公司合成：