[发明专利]一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌蛋白提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白的提取方法，具体涉及一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌蛋白提取方法，属于生物技术领域。

背景技术

猪接触传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia)又称坏死性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种急性呼吸道传染病，以急性出血性纤维素性肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜炎为主要特征。急性者病死率高，慢性者常能耐过。本病于1957年由英国的Pattison首次报道。目前该病在世界上广泛存在，造成了巨大的经济损失。美国、丹麦、瑞士将本病列为主要猪病之一。我国近年来由于引种频繁，该病也随之侵入，其发生和流行日趋严重，已有多个地区报道了此病。

[0002]本病对各种猪均易感，在新引进猪群多呈急性爆发，其发病率和死亡率常在20％以上，最急性型的死亡率可高达80％～100％。该病在我国发生呈逐年上升的趋势，已成为危害养猪业最严重的疾病之一，给我国养猪业造成严重的经济损失。

近年来，由放线杆菌所引起的传染性胸膜肺炎已成为影响养猪业发展的一种重要细菌性疾病。发病后及时采用抗生素进行治疗可显著降低动物死亡率，同时在生产过程中适当添加抗生素也可在一定程度上降低该病的发生率。但随着大量抗菌药特别是广谱抗菌药在养猪业中的广泛使用，细菌对抗菌药物的耐药性问题日趋突出，与此同时也有研究资料表明亚抑制浓度的抗生素可以影响细菌的代谢过程而改变细菌的毒力或细菌对环境的适应能力等。

上个世纪人类对人的基因组进行了研究，对整个基因组进行了测序，其中一些基因的遗传密码被破译，还有些基因的功能未研究清楚。蛋白质是基因功能的体现者，执行生理功能。在众多生物学机制研究中，许多问题在基因水平上不能完全被揭示，所以就要研究其功能，从其体现者蛋白质角度来研究。蛋白质组起初由澳大利亚学者提出，它包含两个方面的含义，一个是蛋白质方面的研究，一个是基因组方面的研究，它的具体含义是细胞或组织基因组所表达的全部蛋白质信息。蛋白质组学是以蛋白质组为研究中心，在整体水平上系统研究细胞或组织的全部蛋白质信息，它具有大规模、高通量的特点。21世纪是生命科学领域大发展时期，基因组学研究已进入后基因组学时代，即功能蛋白质组学。蛋白质组学的研究内容非常广泛主要包括以下几个方面：即结构蛋白质组学、表达蛋白质组学、功能蛋白质组学、差异蛋白质组学等几个方面的内容。双向电泳是蛋白质组学研究中常用的一种蛋白质分离技术，其步骤较多，研究内容复杂，主要包括以下几个方面内容：原料的采集与回收、蛋白质的提取、蛋白质的纯化、蛋白质的透析脱盐、第一向等电聚焦、第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱鉴定、生物信息学分析研究等内容。

双向电泳技术是蛋白质组学研究中常用的一种蛋白质分离技术，包括样品制备、胶条水化、等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶固定及染色等一系列步骤。其中样品制备、等电聚焦和凝胶染色是最关键的，决定了双向电泳能否顺利进行及成败的关键。等电聚焦对样品的要求极其严格，若样品中含有过多杂质将使等电聚焦过程终止。目前有很多种蛋白质提取方法，但没有一种方法是通用的，因此要对不同的生物组织采取不同的措施。细菌中含有大量干扰物质，这些物质严重干扰等电聚焦及影响电泳图谱的分析。

本研究为克服上述困难，发明了一种适合双向电泳的蛋白提取方法，对蛋白提取步骤和所使用的试剂进行了优化，增加了超声波处理方法和延长了超声的处理时间，对细胞内的蛋白进行了有效释放，大大提高了蛋白提取的效率和纯净度。有效除去了双向电泳中干扰第一向和第二向的杂质。建立了一种稳定、高效适用于双向电泳的胸膜肺炎放线杆菌的蛋白提取方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定、高效适用于双向电泳的放线杆菌的蛋白提取方法，本方法操作简便、蛋白提取效率高、杂质少、不干扰第一向等电聚焦和第二向的聚丙烯酰胺凝胶电泳。为胸膜肺炎杆菌的蛋白组学研究及疫苗候选蛋白筛选提供技术支持和理论基础。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明的一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌的蛋白提取方法，其特征和具体操作步骤如下：

(1)取-80℃冷冻菌体，液氮研磨，准确称取0.05g粉末至2ml离心管中；

(2)往离心管中加入等量的蛋白提取液，所用蛋白提取液配方为：0.5M Tris-base，0.1M氯化钾，0.7M蔗糖，30mM盐酸，50mM DTT，50mM EDTA，40mMβ-二巯基乙醇；

(3)将上述溶液充分混匀后，恒温4℃超声震荡30min；