[发明专利]一种基于3D培养体系的扩增造血干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种基于3D培养体系扩增造血干细胞的方法。

背景技术

造血干细胞在治疗白血病、恶性肿瘤、重症非恶性血液系统疾病以及某些遗传性疾病中有广泛的应用，是因为这类细胞具有自我更新、高度增殖、多向分化等能力，这也预示着体外扩增造血干细胞在临床应用上有着广阔的前景。

目前，在造血干细胞的体外培养中，首先是对骨髓、脐带血或者外周血进行密度梯度离心提取单个核细胞，接着进行磁珠分选得到CD34+细胞，然后将造血干细胞放入培养体系中扩增培养。最常使用的传统2D培养，是将造血干细胞悬浮培养于培养瓶或培养板中，再添加血清替代物和多种生长因子，血清替代物由转铁蛋白和人胰岛素等物质组成，生长因子包括干细胞因子(SCF)、FMS样酪氨酸激酶-3配体(FL)、促红细胞生成素(EPO)等。造血干细胞生长因子可调控造血干细胞的存活和增殖，在造血干细胞的培养中是必不可少的部分。

体内的造血干细胞主要存在于骨髓中，约占骨髓细胞总数的0.01％，在一般状态下造血干细胞数目保持不变，但是当有造血需要时，造血干细胞会进行显著的扩增，不同于体外培养，体内的造血干细胞在扩增过程中能够维持自我更新能力，因此体内细胞生长的微环境对于造血干细胞自我更新、扩增具有重要的作用。已有研究表明建立一种3D培养体系对于提高造血干细胞的体外扩增倍数，延长体外培养时间和维持自我更新能力有显著效果。Matthias P.Lutolf成功合成了一种聚乙二醇水凝胶微孔平台用于维持造血干细胞的自我更新和造血系统重塑能力。

生理性乏氧对造血干细胞的生物特性和功能具有保护作用。低氧环境下，体外培养的造血干细胞有更好的集落形成能力，低氧环境可以刺激VEGF、BNIP3、CXCR4等基因的表达，从而通过细胞旁分泌来调节造血干细胞的增殖、凋亡和分化。低氧环境能使造血干细胞扩增更多的较原始的AC133+CD34+造血干细胞和有活性的CD34+造血干细胞，维持较多的干细胞处于G0/G1期，促进各系集落(BFU-E、CFU-GM等)的生长，更好地维持造血干细胞的迁徙能力，但是目前，对影响造血干细胞扩增的氧浓度尚未有系统的确切的研究结果。

传统2D培养体系体外扩增造血干细胞的倍数约为10倍，扩增倍数不理想，且不能为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，使得造血干细胞迅速分化从而失去干细胞特性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开了一种基于3D培养体系扩增造血干细胞的方法，该方法在培养体系中加入生物相容的支架，模拟体内骨髓造血干细胞生长的三维环境，为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，可增加细胞扩增的倍数，同时维持造血干细胞的表型，不易分化，保持造血干细胞的特性。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为，本发明公开了一种基于3D培养体系的造血干细胞扩增方法，方法包括如下步骤：(1)将血液中分离出的造血干细胞悬液置入复合培养基中培养：复合培养基包括无血清干细胞基础培养基、SIFE生长因子、血清替代物、纤维蛋白凝胶；

(2)将(1)的复合培养基置入低氧培养箱中，低氧培养箱维持的氧浓度为3～20％。体内的造血干细胞主要存在于骨髓中，约占骨髓细胞总数的0.01％，在平时状态下造血干细胞数目保持不变，但是当有造血需要时，造血干细胞会进行显著的扩增，不同于体外培养，体内的造血干细胞扩增过程中能够维持自我更新能力，因此体内细胞生长的微环境对于造血干细胞自我更新、扩增具有重要的作用，本发明中添加的纤维蛋白凝胶是一种高分子网络体系，能吸收大量的水份，其结构与细胞外基质极为相似，能够在体外模拟体内造血干细胞的生长微环境，从而为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，而且纤维蛋白凝胶生理、无菌、无毒且具有良好的生物相容性，可通过释放β转化因子和血小板衍生生长因子等来促进细胞粘附、增殖并分泌基质，能够显著增加细胞扩增倍数，同时维持造血干细胞的特性，防止其因分化而丧失干细胞的特性。