[发明专利]一种检测淋巴细胞归巢受体的荧光方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物传感及分析领域，特别涉及一种利用阳离子型共轭聚合物和透明质酸探针检测淋巴细胞归巢受体（CD44）的荧光方法及其试剂盒。

背景技术

共轭聚合物的吸光能力非常强，还具有“分子导线”功能，允许采集的光能或光激发电子在共轭主链上迅速迁移、传递，从而对被检测分子迅速产生群体响应，体现出特有的荧光信号放大作用。因此，共轭聚合物成为近年来传感领域中颇受青睐的报告器材料，相对于传统小分子荧光材料，常具有更好的信号倍增效应和实时检测效果。为了把共轭聚合物应用于生物传感，常在聚合物侧链上引入离子基团，使水溶性增强；通过引入阳离子基团，可使整条聚合物链在水溶液中带正电荷，能与带负电荷的生物分子进行静电结合。

1934年，Meyer等首先在牛眼玻璃体中发现了透明质酸，随后在人体内也发现了它的存在。它和蛋白质、核酸一样，都是生命过程的基本物质，广泛存在于生物体的软结缔组织中，如眼玻璃体、人的脐带、皮肤、关节滑液、雄鸡冠等许多地方。透明质酸是由（1-β-4）D-葡糖醛酸（1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖的双糖单位重复连接组成的带负电的线性黏多糖（Toole BP.Nature,2004,4(7):528-539），相对分子量数量级在10⁴-10⁷，是构成细胞外基质和细胞间质的主要成分（Evanko SP,Park W T,Wight T N.J Histochem Cytochem,2004,52(12):1525-1535;Hascall V C,Majors A K,De La Motte C A,et al.Biochim Biophys Acta,2004,1673(1-2):3-12)。透明质酸分子中含有的大量羧基、羟基、酰胺基，在生理条件或适当的pH环境下，羧基可充分解离成负离子。因此，透明质酸具有突出的保水性能，它的水溶液既具有凝胶的弹性、也具有溶液的粘性，即粘弹性的双重特征。透明质酸通过作用于细胞及其受体，在间质的转移、肿瘤细胞的侵袭、畸胎癌细胞的分化等过程中起着重要作用。近年来，基于透明质酸独特的理化性质和生理功能，它已经在诸多方面得到广泛应用，例如：保护眼睛、保护和润滑关节、促进血管生成、促进伤口愈合及肿瘤的治疗等。

目前所研究的透明质酸在抗肿瘤中的作用主要是通过其与受体CD44结合而实现的。CD44，又称淋巴细胞归巢受体，是多种恶性肿瘤细胞表面的一种跨膜糖蛋白，相对分子质量为（80-90）×10³（Fujita Y,Kitagawa M,Nakamura S,et al.FEBS Letter,2002,528(1-3):101-108)，它与恶性肿瘤细胞周围的透明质酸通过特异性作用结合，利用透明质酸形成的水合性通道促进肿瘤细胞的转移。研究表明，CD44的表达与肿瘤的转移和表达呈正相关，对透明质酸与CD44的结合进行有效地控制已在一些肿瘤细胞的转移和生长抑制中取得了令人瞩目的成就。因此，对CD44进行高效的检测在肿瘤的早期诊断和治疗等方面具有重要的理论和应用研究价值。

目前市面上检测CD44的常见方法是利用双抗体夹心法的ELISA试剂盒。它的原理是先利用CD44的单克隆抗体固定待检测的CD44抗原，再与修饰了生物素功能基团的CD44抗体作用，然后与辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；经过彻底洗涤后用底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色。TMB在HRP的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深度和样品中的CD44浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。这种方法虽然可以达到高的灵敏度和优良的特异性，但是操作费时，成本较高。找到一种既能特异性检测CD44，又操作简便、快速、成本低的检测方法，成为亟待解决的问题。

发明内容

技术问题：本发明要解决的第一个技术问题是针对现有ELISA试剂盒检测CD44方法的不足，提供一种利用透明质酸探针，并用阳离子型水溶性共轭聚合物进行荧光信号放大来检测CD44的方法，灵敏度和特异性好，并且操作简便、快速，成本低。

本发明要解决的第二个技术问题是提供采用上述检测方法的试剂盒。