[发明专利]神经干细胞来源Exosomes制备及在神经系统疾病中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞研究，属表观遗传学、细胞生物学、分子生物学领域及临床应用，具体涉及人脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞及大鼠的神经干细胞所分泌、释放的胞外体（Exosomes）的制备、纯化、鉴定方法，以及Exosomes在治疗神经系统疾病中的应用，为替代神经干细胞治疗神经系统疾病提供了新的治疗手段与技术支持。 

  

背景技术

神经干细胞（neural stem cell，NSC)是一种终身具有自我更新能力的细胞，其子细胞能分化产生神经系统的各类细胞，干细胞经过不对称分裂产生一个祖细胞和另一个干细胞，祖细胞具有有限的自我更新能力，并自发分化产生成神经元细胞和成胶质细胞等，从而生成神经元及神经胶质细胞。以往认为中枢神经系统的神经元再生于出生前或出生后不久就停止了。近年的一些研究表明成年哺乳动物的脑组织仍然可不断产生新的神经元，并且证实在人脑组织中同样存在神经干细胞。因此，人们对神经系统再生的机理和神经系统疾病的治疗均有新的认识。 

     对于神经干细胞具体是如何让发挥作用的，人们根据国内外大量的动物实验和临床实践，推测神经干细胞移植可以通过两种途径进行神经损伤修复：1、移植的神经干细胞可以自我分辨并迁移到损伤的神经部位，通过细胞替代作用更换机体已经死亡或受损伤的神经细胞，修复受损神经网络；2、中枢神经系统（包括脑和脊髓）损伤后，损伤中心周边的大量神经细胞虽然健存，但受到损伤的影响，转入休眠或功能抑制状态。移植的神经干细胞可以分泌大量神经营养因子，激活这些神经细胞，从而改善机体的神经功能。 

    我们通过实验发现神经干细胞可以分泌一种胞外体（Exosome），它直径50—150nm，包裹着神经干细胞内特殊的蛋白质、mRNA、microRNA及DNA碎片等活性物质。与神经干细胞分泌的其他囊泡相比，Exosomes具有更清晰的生物学特性，并且我们通过动物实验证实了由神经干细胞分泌的这种胞外体可发挥神经干细胞功能，对神经元具有刺激修复功能。 

近年来Exosomes生物学特性的研究其来源集中于树突状细胞及肿瘤细胞，神经干细胞来源的Exosomes尚未见报道。本实验室经研究提出Exosomes是神经干细胞发挥治疗作用的核心机制。Exosomes既具有神经干细胞类似的生物学功能，又具有不同于干细胞的众多优点。Exosomes避免了干细胞应用时的生物安全问题（肿瘤，基因污染，感染）、伦理问题、保存和运输问题等。Exosomes离体条件下可在-20℃保存6个月，无潜在毒性，且生物化学活性不受影响；其表面的复合分子为其靶向特定组织及微环境提供了一个潜在的归巢机制；可使治疗性的蛋白质、RNA通过吞噬、食菌、膜融合的方式进入受损细胞；具有足够的潜力参与广泛的生物化学及细胞活性反应。在临床上比干细胞具有更强的应用性，是一种全新的非干细胞的“干细胞”治疗途径。 

根据Exosomes结构和功能的特性，通过工艺的改良，可达到“低投入、高产出”的目的。并且我们认为Exosomes可进行人工或半人工的制备，既保留了与干细胞相同的生物学特性与功能，又可对其进行靶向加工，突破干细胞的局限性，制成更加具有临床应用前景且能够替代干细胞治疗的“Super Exosomes”。 

发明内容

本发明的目的是提供了人源性和鼠源性两种来源的神经干细胞分泌的胞外体（Exosomes）的制备、纯化工艺，并提供了该胞外体在治疗神经系统疾病中的应用。通过动物实验证实了所提取的神经干细胞来源的Exosomes具有类似于神经干细胞的功能，是神经干细胞治疗中发挥作用的核心物质，可作为神经干细胞的替代物治疗神经系统疾病。 

 本发明中的要点之一：Exosomes具有源细胞胞膜脂质成分及其表面标记蛋白，不进行代谢，可发挥干细胞类似的功能作用，但又具有不同于细胞的众多优点，是一种介导细胞间信息传递的亚细胞结构信息复合体。 

本发明要点之二：Exosomes不能够分裂增殖，既是干细胞治疗中发挥作用的核心物质，又无致瘤性，安全性高，易于保存，可成为替代干细胞治疗的治疗手段。 

本发明要点之三：提高干细胞源胞外体的提取率及其活性的维持，从而进行治疗目的规模生产，本发明公开了胞外体的制备、纯化及鉴定方法，具体方法均为现有技术，但整个提取过程，耗时短，产量高，所得胞外体保持了其较高的生物活性，形态结构完整，均一度高。更好地为新的非干细胞的“干细胞”治疗途径提供技术支持。