[发明专利]克隆禽α-干扰素的通用引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及禽α-干扰素的克隆，尤其是涉及未知的禽α-干扰素的克隆的通用引物及其应用。属于生物技术领域。

背景技术

α干扰素也称为白细胞干扰素,它具有较强抗病毒、抗肿瘤、抗增殖作用等功能。自发现干扰素以来，由于其广谱抗病毒、抗肿瘤以及强大的免疫调节作用而成为免疫学、病毒学、细胞生物学、分子生物学、临床医学、肿瘤学等相关领域的研究热点。自1957年干扰素被发现以来，直到1994年鸡α-干扰素才刚刚被克隆。干扰素的研究在禽类起步较晚，现阶段已被克隆出来的α-干扰素的全序列的鸟类只有鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鹧鸪、鹦鹉、火鸡等。对于干扰素基因的克隆，现在主要有以下两种方法，尚不存在禽类α-干扰素的通用引物的使用。

方法一：目前对于干扰素的克隆，引物的设计大多数是参考与之亲缘关系相近的已知序列（如：鹅α-干扰素基因的克隆引物是参考鸭α-干扰素基因序列设计的），该方法的优点是有可能一次性克隆出干扰素的全序列，但是其缺点是对于参考的物种有一定的局限性，若参考的物种与要克隆的物种亲缘关系不能在同一目下，很难克隆出来。

方法二：除技术一中所提及的，对于未知干扰素的克隆通常还会用到5’端cDNA快速扩增（5’-RACE）和3’端cDNA快速扩增（3’-RACE），RACE（rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。另外除上述方法，当下基因组步移技术（如反向PCR、载体PCR、接头PCR、热不对称交错PCR、高通量染色体步移等）也是获取侧翼序列的常用方法。而上述方法缺点是需建立在一段已知序列的基础上，而如果对于完全未知的序列该方法则无法有效使用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于克隆禽IFN-α基因的通用引物，以解决禽类未知的α-干扰素克隆起步困难的问题；同时该引物亦可以作为禽IFN-α基因的通用引物，用于禽类IFN-α基因的鉴定和筛选工作。本发明不涉及物种选取的局限性，对禽类都适用，而且也无需建立在一段已知序列的基础上，因此本发明的提出将更有利于对未知禽IFN-α基因的克隆以及为后续克隆提供理论和事实依据。

为了达到上目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明根据10种已知禽IFN-α基因的序列分析出三段相对较为保守的核苷酸序列，以这三段序列为依据设计并合成克隆禽IFN-α基因的三条简并引物。其中一条上游简并引物AIF-TY1a的核苷酸序列为：

5’-CASCRSYACRBCCASCASCTCSAGC-3’（SEQ ID NO.1所示），另一条上游简并引物POAU的核苷酸序列为：5’-CYRSYSCTCNYGCTCCTYCT-3’（SEQ ID NO.2所示），其共同的下游简并引物AIF-TY2b的核苷酸序列为:5’-AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’（SEQ ID NO.3所示）。其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，B=C/G/T，N=A/C/G/T）。

AIF-TY1a，AIF-TY2b和POAU，AIF-TY2b两对简并引物分别从鸡行目（Galliformes）中的家鸡（序列的登录号：HQ008781）、雁形目（Anseriformes）中的鸭（序列的登录号：HQ008783）和鹅（序列的登录号：HQ115583）的基因组DNA中PCR扩增出IFN-α基因。由此证明对于已克隆出的禽IFN-α基因的物种，该对简并引物能够克隆出IFN-α基因，为这对引物的有效性提供了实例。与此同时，该对引物也能从鹤形目（Gruiformes）中的丹顶鹤和鸡行目（Galliformes）中的孔雀这两种野生动物的基因组DNA中克隆出IFN-α基因，证明在未被克隆出来的干扰素的物种中该对引物也是有效的。综上所述，该两对引物是能够从多数禽类基因组DNA中扩增出IFN-α基因，扩增长度分别大约为167bp，480bp。因此，本发明人提出了本发明。