[发明专利]利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素的方法

权利要求书

1.一种利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）将菌株接种到完全培养基的斜面上，在28～37℃条件下培养2～5天，制成斜面种子；

2）将斜面种子上的单菌落或孢子在无菌条件下接种到摇瓶中，在28～37℃条件下培养12～48h，再将摇瓶内培养好的菌液转接到一级种子培养基中，在28～37℃条件下培养12～48h，得到一级种子；

3）按照发酵罐体积的1～3%取一级种子接种于发酵罐内，在28～37℃、起始pH=5.0～7.5的条件下进行培养，至菌体浓度达到最大值时停止发酵，得到一次发酵营养液；

4）将所述一次发酵营养液用孔径0.01～1μm的陶瓷膜在0.05MPa～0.5MPa条件下进行过滤，收集第一截留物得到菌体，或者用离心机在4000～8000rpm条件下离心分离15～30min，收集沉淀得到菌体，再将所述菌体用无菌水洗涤2～3次；再进行离心分离，得到一级菌体；

5）将所述一级菌体置于磷酸盐缓冲液中制得菌悬液，向菌悬液中加入0.5～3wt%的酶，充分混合后静置0.5～2h，然后将其放入高压匀浆机，在85～95MPa条件下多次匀浆，得到细胞破碎混合液；

6）将细胞破碎混合液用0.01～1μm的陶瓷膜在0.05～0.5MPa条件下过滤，收集滤过液得到粗蛋白液；或者用离心机在4000～8000rpm条件下离心分离15～30min，收集上清液得到粗蛋白液；

7）将所述粗蛋白液利用5～20wt%的蔗糖梯度溶液在60000～80000rpm条件下进行4～6h梯度离心，收集浓度为5～10wt%蔗糖溶液带内的沉淀物即为所述泛素及类泛素；或者用截留分子量为14万的超滤膜过滤所述粗蛋白液，收集滤过液并将其用截留分子量为4000～12000的中性超滤膜过滤，收集第二截留物即得所述泛素及类泛素；

步骤1）中所述菌株为大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、丙酸杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、果糖芽孢杆菌、芽孢梭菌、微球菌、链球菌、明串珠菌或对人体无致病作用的霉菌、放线菌和酵母菌，或原生生物中的藻类。

2.一种利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素粉的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）将菌株接种到完全培养基的斜面上，在28～37℃条件下培养2～5天，制成斜面种子；

2）将斜面种子上的单菌落或孢子在无菌条件下接种到摇瓶中，在28～37℃条件下培养12～48h，再将摇瓶内培养好的菌液转接到一级种子培养基中，在28～37℃条件下培养12～48h，得到一级种子；

3）按照发酵罐体积的1～3%取一级种子接种于发酵罐内，在28～37℃、起始pH=5.0～7.5的条件下进行培养，至菌体浓度达到最大值时停止发酵，得到一次发酵营养液；

4）将所述一次发酵营养液用孔径0.01～1μm的陶瓷膜在0.05MPa～0.5MPa条件下进行过滤，收集第一截留物得到菌体，或者用离心机在4000～8000rpm条件下离心分离15～30min，收集沉淀得到菌体，再将所述菌体用无菌水洗涤2～3次；再进行离心分离，得到一级菌体；

5）将所述一级菌体置于磷酸盐缓冲液中制得菌悬液，向菌悬液中加入0.5～3wt%的酶，充分混合后静置0.5～2h，然后将其放入高压匀浆机，在85～95MPa条件下多次匀浆，得到细胞破碎混合液；

6）将细胞破碎混合液用0.01～1μm的陶瓷膜在0.05～0.5MPa条件下过滤，收集滤过液得到粗蛋白液；或者用离心机在4000～8000rpm条件下离心分离15～30min，收集上清液得到粗蛋白液；

7）将所述粗蛋白液利用5～20wt%的蔗糖梯度溶液在60000～80000rpm条件下进行4～6h梯度离心，收集浓度为5～10wt%蔗糖溶液带内的沉淀物即为所述泛素及类泛素；或者用截留分子量为14万的超滤膜过滤所述粗蛋白液，收集滤过液并将其用截留分子量为4000～12000的中性超滤膜过滤，收集第二截留物即得所述泛素及类泛素；

8）将所述泛素及类泛素置于喷雾干燥机内，在进口温度120～150℃、出口温度62～73℃条件下进行喷雾干燥，得到所述泛素及类泛素粉；

步骤1）中所述菌株为大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、丙酸杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、果糖芽孢杆菌、芽孢梭菌、微球菌、链球菌、明串珠菌或对人体无致病作用的霉菌、放线菌和酵母菌，或原生生物中的藻类。