[发明专利]利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素的方法。

背景技术

泛素蛋白由76个氨基酸残基组成，其分子量约为8.5kDa，以“泛素”为名是因为它在生物体中广泛存在。泛素一个最主要的功能就是帮助清理细胞，标记需要分解掉的蛋白质，将受损、老化、凋零的细胞及蛋白质分解，以实现蛋白的再循环利用，对病变、损伤、衰老的细胞进行定位清除，使其被水解。

随着社会进步和经济发展，人们的生活节奏不断加快，对于保健品和保养品的需求也日益增多。虽然高科技医学治疗技术、诊断技术日新月异，但是却无法阻挡慢性病大量发生且快速蔓延的趋势。目前尚未发现有效药物或手术能够预防、消除甚至治疗任何慢性病。

通过泛素补充机体本身存在的再生修复因子，利用几乎所有组织器官中均存在的干细胞的自动再生修复功能，很方便的用自身生产的“原配件”自动修复或再造因任何病变、损伤而衰老的细胞和组织。进行自再生修复和复原，达到对病变、损伤、衰老细胞进行定位的新陈代谢，使生命环境复原。因此泛素及类泛素食品有助于治疗慢性疾病。

自1975年泛素在小牛胰脏中分离出来，目前国内外已对泛素及类泛素作用的机理、纯化、应用作了大量的研究。但是现在尚未见到利用发酵获得菌体蛋白提取生产泛素及类泛素的方法。

发明内容

为了解决现有泛素、类泛素生产过程复杂、生产价格昂贵的技术问题，本发明提供了一种利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素的方法，该方法选用原料价格低廉，有效降低生产价格，且制备过程简单，可用于大规模生产。

为此，本发明技术方案如下：

一种利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素的方法，包括如下步骤：

1）将菌株接种到完全培养基的斜面上，在28～37℃条件下培养2～5天，制成斜面种子；

2）将斜面种子上的单菌落或孢子在无菌条件下接种到摇瓶中，在28～37℃条件下培养12～48h，再将摇瓶内培养好的菌液转接到一级种子培养基中，在28～37℃条件下培养12～48h，得到一级种子；

3）按照发酵罐体积的1～3%取一级种子接种于发酵罐内，在28～37℃、起始pH=5.0～7.5的条件下进行培养，至菌体浓度达到最大值时停止发酵，得到一次发酵营养液；

4）将所述一次发酵营养液用孔径0.01～1μm的陶瓷膜在0.05MPa～0.5MPa条件下进行过滤，收集第一截留物得到菌体，或者用离心机在4000～8000rpm条件下离心分离15～30min，收集沉淀得到菌体，再将所述菌体用无菌水洗涤2～3次；再进行离心分离，得到一级菌体；

5）将所述一级菌体置于磷酸盐缓冲液中制得菌悬液，向菌悬液中加入0.5～3wt%的酶，充分混合后静置0.5～2h，然后将其放入高压匀浆机，在85～95MPa条件下多次匀浆，得到细胞破碎混合液；

6）将细胞破碎混合液用0.01～1μm的陶瓷膜在0.05～0.5MPa条件下过滤，收集滤过液得到粗蛋白液；或者用离心机在4000～8000rpm条件下离心分离15～30min，收集上清液得到粗蛋白液；

7）将所述粗蛋白液利用5～20wt%的蔗糖梯度溶液在60000～80000rpm条件下进行4～6h梯度离心，收集浓度为5～10wt%蔗糖溶液带内的沉淀物即为所述泛素及类泛素；或者用截留分子量为14万的超滤膜过滤所述粗蛋白液，收集滤过液并将其用截留分子量为4000～12000的中性超滤膜过滤，收集第二截留物即得所述泛素及类泛素；

步骤1）中所述菌株为大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、丙酸杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、果糖芽孢杆菌、芽孢梭菌、微球菌、链球菌、明串珠菌、或对人体无致病作用的霉菌、放线菌和酵母菌，或原生生物中的藻类。

一种利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素粉的方法，包括如下步骤：

1）将菌株接种到完全培养基的斜面上，在28～37℃条件下培养2～5天，制成斜面种子；

2）将斜面种子上的单菌落或孢子在无菌条件下接种到摇瓶中，在28～37℃条件下培养12～48h，再将摇瓶内培养好的菌液转接到一级种子培养基中，在28～37℃条件下培养12～48h，得到一级种子；

3）按照发酵罐体积的1～3%取一级种子接种于发酵罐内，在28～37℃、起始pH=5.0～7.5的条件下进行培养，至菌体浓度达到最大值时停止发酵，得到一次发酵营养液；