[发明专利]一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法

权利要求书

1.一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法，其特征在于按照如下步骤操作：1）利用体内和体外实验确定激活素A发挥作用的关键时期是出生前12天到出生后7天：利用机械法分离12.5dpc的胎鼠卵巢组织在37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，培养液A包含88%α-MEM，10%胎牛血清，1%丙酮酸钠，1%青链霉素，10mIU促卵泡素；培养分为四个阶段，每个阶段7天，共28天；在每个阶段分别设置不添加激活素A组，培养到28天时，收集胎鼠卵巢，并撕成碎小的组织块，0.25％胰酶，0.2％胶原酶IV，37℃处理10min，加入10%的胎牛血清+90%的DMEM配成的终止液后洗涤3次后，用口吸管收集裸卵，在磷酸盐缓冲液中反复洗涤，直至收集的样品中不再含有颗粒细胞；然后统计不同组的卵母细胞数目和直径大小；发现激活素A从小鼠出生前12天开始到出生后7天都发挥作用；2）利用细胞荧光染色和western blot检测减数分裂相关基因和蛋白的表达情况，确定激活素A促进雌性生殖细胞第一次减数分裂的进程：12.5dpc胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作：生殖嵴分离出来培养的当天定为0天，分离出的12.5dpc胎鼠生殖嵴，在37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，贴壁培养4天，培养液包含88%α-MEM，10%胎牛血清，1%丙酮酸钠，1%青链霉素，10mIU促卵泡素，100ng/ml激活素A；通过实时荧光定量PCR、细胞荧光染色和western blot检测手段，确定激活素A加速第一次减数分裂的进程；3）利用免疫荧光组化的方法统计各组中原始卵泡的形成情况，激活素A促进原始卵泡库的建立：12.5dpc胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作：分离出12.5dpc胎鼠生殖嵴，在37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱里培养，培养液成分同步骤2）；每两天换半液，悬浮培养4天后转为体外立体培养6天，通过荧光免疫组化检测发现激活素A促进在体外培养条件下的原始卵泡库形成；结果表明，激活素A加速体内原始卵泡库的建立；4）激活素A对雌性生殖细胞第一次减数分裂相关基因和蛋白的影响：利用RT-qPCR方法检测减数分裂相关基因Stra8、Dazl、Scp3、Rec8、Spoll和Dmc1的变化，激活素A处理组的Stra8表达量极显著升高，Dazl、Scp3和Dmc1表达量显著升高；借助免疫细胞化学检测技术，利用MVH标记生殖细胞后检测了生殖细胞DAZL和STRA8的阳性率，发现激活素A显著增加了表达DAZL和STRA8的生殖细胞比例；同时，Western blot结果显示，添加激活素A后，DAZL、SCP3和STRA8减数分裂相关蛋白都显著升高。 

2.根据权利要求1所述的一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法，其特征在于：为了更准确地了解激活素I型和II型受体在整个卵巢发生过程中的定位和表达模式，分别采用定量PCR和蛋白印迹方法对其转录和翻译水平的表达量进行分析：定量PCR结果表明：在12.5dpc的胎鼠卵巢中检测到激活素受体IA、IB、IIA和IIB的表达，且随着卵母细胞发育，激活素受体IA和IB在7dpp时表达量达到峰值，与出生前卵巢中激活素受体IA和IB的表达量相比差异 极显著；而激活素受体IIA和IIB表达量到0dpp时达到峰值，与出生前卵母细胞中的表达量相比差异显著；检测7dpp的卵巢发现激活素受体IIA和IIB表达呈现下降的趋势，但相较其它时期仍处于较高表达水平；卵巢发育到14dpp时，激活素受体IA、IB、IIA和IIB表达水平都降到最低值，与0dpp或7dpp时相比差异显著；蛋白印迹分析结果显示，激活素受体IB和IIB在翻译水平的表达趋势与转录水平一致。