[发明专利]猪葡萄球菌脱落毒素分型的多重荧光PCR检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种多重荧光PCR方法及试剂盒，特别涉及一种猪葡萄球菌4种脱落毒素分型（EXHA、EXHB、EXHC和EXHD）的多重荧光PCR方法及试剂盒。

背景技术

葡萄球菌产生的脱落毒素可以引起人和动物发生严重的皮肤性疾病。例如金黄色葡萄球菌可引起人的烫伤样皮肤综合症，猪葡萄球菌可引起仔猪发生渗出性皮炎。目前发现的脱落毒素有9种，包括金黄色葡萄球菌产生的ETA、ETB和ETD，以及猪葡萄球菌产生的EXHA、EXHB、EXHC和EXHD，还有日本研究人员发现的另外两种猪葡萄球菌毒素蛋白SHETA和SHETB。

猪葡萄球菌（S.hyicus）可以引起猪群发生大规模的渗出性皮炎病（Exudative Epidermitis,EE），它是一种急性、高度接触性的猪传染病，患猪以急性全身性渗出性皮炎为主要特征，该病又称溢脂性皮炎或煤烟病。本病主要感染5-6日龄的初生哺乳仔猪、刚断奶的仔猪以及母猪乳房上。该病原可通过各种途径感染，主要以破裂和损伤的皮肤黏膜引起动物的感染。据国内外的研究结果表明它的发病率为80%；死亡率5%～90%不等；少数存活的病猪常导致生长发育障碍形成“僵猪”。

猪葡萄球菌所产生的这些脱落毒素是造成猪渗出性皮炎的主要致病因子之一，它是一种细胞外分泌的蛋白质，分子量大约30KD。丹麦研究者首先通过PCR和Western-blot对产生的脱落毒素进行了分析和研究，将脱落毒素分为4种类型，并分别命名为EXHA、EXHB、EXHC、EXHD，其中EXHD的抗原性不同于其他3种毒素的抗原性。这4种脱落毒素的基因大小约为816bp～834bp，这些基因携带一些质粒，并受这些质粒的调控。

由于猪葡萄球菌在嗜菌型、血清型和DNA指纹型方面具有多型性(Andresene tal,1993)，发病猪中同时存在不同型的S.hyicus，从而使诊断变得复杂。Wegener发现从每个病猪的皮肤上任选分离出的10株S.hyicus中，平均包含1.9种不同的噬菌体型和2.3种不同的抗生素型。从动物肝、脾中分离到的菌株的多样性则稍低一些。目前，在实验室诊断中缺少简易方法来区分毒力型和非毒力型菌株，所以各型S.hicus都应被看做潜在的毒力型菌株。但是，由于引起该病的病因很复杂，而且易与其它皮肤病变混淆，如脂痘，疥癣，癣，玫瑰糖疹，缺锌，增生性皮肤病等。因此，在诊断过程中要选择特异性强、灵敏度高的检测方法进行鉴别诊断。

目前，对猪葡萄球菌产生的脱落毒素采用的诊断方法主要是细菌学的分离鉴定、生化试验、冰冻组织切片、免疫印迹分析、酶联免疫（ELISA）、PCR和多重PCR方法等。

以上这些方法虽然已经得到了推广应用，但是都存在耗费时间长、灵敏性和特异性欠佳等缺陷，对实际生产的指导意义不大。因此，建立一种快速、高效、准确的多重荧光PCR诊断方法已迫在眉睫。

发明内容

为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种猪葡萄球菌脱落毒素分型的多重荧光PCR检测引物组，其中包括检测EXHA、EXHB、EXHC及EXHD的4组特异性引物和4条Taqman探针。

本发明的另目的在于提供包含上述检测引物组的猪葡萄球菌脱落毒素分型的多重荧光PCR检测试剂盒，从而使检测达到灵敏、快速、准确、节约材料和试剂的目的。

本发明的再一目的在于提供上述检测试剂盒检测猪葡萄球菌脱落毒素分型的多重荧光PCR方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种猪葡萄球菌脱落毒素分型的多重荧光PCR检测引物组，包括用于检测EXHA、EXHB、EXHC及EXHD的4组引物和4条Taqman探针；

所述的4组引物为：

所述的Taqman探针由5’端带有的荧光物质，Taqman探针的序列和3’端带有的淬灭物质组成；

所述的5’端带有的荧光物质优选为FAM、JOE、TAMRA、Cy5中的至少一种；

所述的3’端带有的淬灭物质优选为BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的至少一种；

所述的4条Taqman探针的序列如下：

优选的，上述4条Taqman探针如下：

EXHA-Prob-FAM FAM-tgaagcgccttttggagcagga-BHQ