[发明专利]金黄色葡萄球菌HI重组蛋白的发酵和纯化工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种制备金黄色葡萄球菌（SA）HI重组蛋白的发酵工艺和纯化工艺。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)，以下简称金葡菌，有“嗜肉菌”的别称。作为革兰氏阳性菌的代表，它是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌。感染以急性、化脓性为特征，局部感染可引起皮肤和软组织等的化脓性感染，经久不愈；全身感染可导致骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、肺炎、脓毒血症等严重感染及并发症，死亡率高达20％。同时，金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。因此，加强对金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌基因工程疫苗将对有效控制金葡菌耐药性蔓延和临床金葡菌广泛感染具有重要的战略及现实意义。

本申请发明人前期构建了一种金黄色葡萄球菌重组蛋白HI，由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌α-溶血素无毒突变体与铁离子表面决定蛋白活性片段重组而成，并对该蛋白提交了中国专利申请（CN102993308A），该申请全部通过引用的方式结合至本文。

发明内容

本申请在上述内容的基础上，进一步提供所述HI重组蛋白基因工程菌的发酵、纯化及去内毒素工艺。

在本申请中，HI蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在第一个方面，本发明提供HI重组蛋白基因工程菌的发酵工艺，包括将一定量的种子菌接种于含有甘油和一定溶氧量的培养基中，经诱导剂诱导一定时间而表达重组蛋白。

优选地，所述工艺涉及培养基、种子菌接种量、培养基中的甘油量、溶氧量、诱导剂种类、诱导剂浓度、诱导温度及诱导时间几方面因素对大规模、高密度地生产HI重组蛋白基因工程菌的影响。

进一步优选地，所述培养基可以是动物源性TB、动物源性M9、植物源性TB、植物源性M9，优选为动物源性TB；所述种子菌的接种量是5%～15%，优选为10%；所述甘油量为5-15ml/L培养基，优选为10ml/L培养基；所述溶氧量是25%～65%，优选为45%；所述诱导剂可以是乳糖或IPTG，优选为IPTG；所述诱导剂的浓度是0.1～1mM，优选为0.2mM；所述诱导温度为16～37℃，优选为30℃；所述诱导时间为1～6小时，优选为5小时。

在所述发酵工艺的一种具体实施方式中，基础培养基选用动物源性TB培养基，其中甘油量是10ml/L；发酵开始时，种子菌的接种量比例是10%；在发酵过程中溶氧浓度保持在45%；诱导时，温度调为30℃、IPTG浓度为0.2mM、诱导5h。

本领域技术人员应当理解，所述种子菌是含有能够表达HI蛋白的载体的大肠杆菌；优选地，所述大肠杆菌是XL-1Blue；所述载体是pGEX-6p-2。根据CN102993308A以及本申请记载的内容，本领域技术人员可以知道如何制备本发明所需要的HI生产种子菌。

在第二方面，本发明还提供一种HI重组蛋白基因工程菌发酵后的蛋白纯化工艺，包括依次进行的GST-琼脂糖凝胶4B亲和层析、阳离子交换层析、置换缓冲液及去内毒素。

优选地，所述阳离子交换层析使用MMC层析柱，使用的缓冲液为，缓冲液A:25mMNaAC-HAc，pH4.5，缓冲液B:50mM PB+1M NH₄Cl，pH7.0；上样流速为4.7ml/min，洗脱流速：4.7ml/min；洗脱程序：0-100%B，20个柱体积（CV）；优选地，上样pH值为7.0-7.5，洗脱pH值为11.0。

优选地，所述置换缓冲液使用G25层析柱；使用缓冲液为疫苗稀释液。

优选地，去内毒素使用Q HP层析柱；使用缓冲液为，缓冲液A：疫苗稀释液；缓冲液B：1M NaOH；

在优选实施方案中，进行亲和层析之前，需要对基因工程菌进行菌体破碎，以将蛋白从菌体中释放出来。

本发明提供的发酵工艺能够大规模、高密度地生产HI重组蛋白基因工程菌体；本发明提供的纯化工艺针对HI重组蛋白的蛋白特性，能够高效地获得得率高、纯度好的精制蛋白原液。

附图说明

图1、工程菌pGEX-6P-2-HI/XL1-Blue细菌在四种培养基中的生长曲线。

图2、HI重组蛋白在M9和TB培养基中的表达情况。1：蛋白质分子量标准；2：M9；3：TB。

图3、不同IPTG浓度对HI重组蛋白表达的影响。1：蛋白质分子量标准；2：0.1mM；3：0.2mM；4：0.5mM；5：1mM。