[发明专利]醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物催化技术领域。具体涉及一种醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法。

背景技术：

环糊精是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6～12个D-吡喃葡萄糖单元。研究较多且具有重要实际意义的是含有6、7、8个葡萄糖单元的分子，分别称为α-CD、β-CD和γ-CD。环糊精具有独特的“内疏水”“外亲水”的笼形结构，可以包结许多无机、有机和手性客体分子形成主-客体包结物，是目前最重要的具有包结作用的环状化合物。近年来随着许多新型环糊精衍生物的问世，如酯化、醚化，烷基化、羟基化等修饰而得到环糊精衍生物，可以改善环糊精的某些理化性质和包结能力，极大地扩展环糊精的应用领域。

在甾体药物中间体的生物催化过程中，甾体底物的水难溶性一直是甾体工业的关键和难点技术。利用环糊精的特殊性质，将环糊精与甾体分子包结起来，可以有效提高甾体在水溶液中的溶解度，从而提高微生物对甾体化合物的生物转化效率。β-环糊精（β-cyclodextrin，简称β-CD）及其衍生物能与甾体底物作用，使其在水相容易分散，增强甾体底物与细胞的作用；也能作用于甾体催化的产物，减少甾体产物的反馈抑制。随着环糊精及其衍生物在生物转化领域的应用，环糊精在生物转化方面的作用已相当明显，应用也逐渐成熟，逐步走向工业生产阶段。

但是，环糊精的价格相对较高是目前限制其在生物催化技术中应用的主要原因。在环糊精介质生物催化反应体系中，利用环糊精的循环利用技术降低环糊精介质的利用成本，是环糊精催化介质在工业生物催化应用中亟待解决的重要技术问题。目前国内外关于疏水化合物生物催化反应中环糊精的循环利用技术还未见报道。

同时在利用游离细胞进行的生物催化反应中环糊精介质进行循环存在几个问题：

（1）细胞利用率低，游离细胞只能使用一次，成本高，污染大。

（2）产物杂质多。利用游离细胞催化醋酸可的松生产醋酸泼尼松的反应体系中存留有大量的菌体、蛋白等杂质，增加了后续产物分离纯化工艺的负担，不利于环糊精的循环利用等。

发明内容：

为了解决上述问题，本发明提供了一种醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法。

本发明的技术方案为：在以醋酸可的松为底物，环糊精为促溶剂，固定化细胞为催化剂的生物催化反应体系中，反应结束后

（1）将含有环糊精的转化液粗过滤回收固定化细胞；

（2）将粗过滤后的滤液离心、有机溶剂萃取；

（3）将所得的含有环糊精的萃余相除去残留有机溶剂；

（4）测定水相中环糊精的剩余量，并补加环糊精；

（5）将补加环糊精后的水相和回收的固定化细胞重新用于醋酸可的松的生物催化中。

所述的环糊精为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟乙基-β环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟丁基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、葡萄糖基胺基-β-环糊精、甲基-β-环糊精或羟丙基-γ-环糊精中的一种。

所述的转化液粗过滤采用纱布或20-50目的筛网进行过滤。

所述的萃取剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、二氯甲烷或三氯甲烷中的一种或几种。

所述的萃取剂与滤液的体积比为1-10：1，萃取次数为1-7次。

所述的除去残留有机溶剂的方法为减压蒸馏、蒸馏、精馏中的一种或多种。

所述的固定化细胞为简单节杆菌固定化细胞或球形节杆菌固定化细胞。

所述环糊精的测定方法为：采用Phenomenex Luna NH₂100A(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，流动相为乙腈-水=60:40（v/v)，流速1.0mL/min，RID示差折光检测器,进样量20μL,柱温30℃。

有益效果：

（1）本发明可以实现环糊精和催化细胞的循环利用，实现疏水化合物生物催化清洁生产、环境友好，节约生产成本的要求。

（2）本发明提供的方法工艺简单、降低环糊精介质和制备细胞的成本，节约资源，带来很大的经济效益。

（3）以循环5次使用的环糊精作为促溶剂的催化体系中，醋酸可的松的的转化率仍然维持在93%以上，在高度节约成本的基础上仍能维持较高的生产效率。

附图说明：

图1为羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）和固定化细胞循环利用1-6次后醋酸可的松转化率变化情况

具体实施方式：