[发明专利]基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法

权利要求书

1.一种基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，包括以下步骤：

1）将裸金电极抛光,洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10～15min，再取出清洗、干燥；

2）将巯基标记的捕获探针滴加于上述金电极上，置于4℃冰箱中过夜；

3）将步骤2中的金电极取出，冲洗，用6-巯基-1-己醇封闭1～1.5h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极30～40min；

4）将步骤3中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加待测样品溶液，37℃反应1～1.5h，然后在金电极上滴加提前制备好的环化DNA，37℃反应1～1.5h；

5）将步骤4中的金电极取出冲洗，加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应液，37℃滚环扩增1～1.5h；

6）将步骤5中的金电极取出冲洗，加入用2×SSC杂交液配制的金纳米探针，37℃杂交1～1.5h，用DEA缓冲液清洗电极；

7）在步骤6中的金电极上加入含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的1.25μg/mL的ST-AP，37℃反应30～45min，用DEA缓冲液冲洗后，置入用DEA缓冲液配制的0.75mg/mL的α-NP底物溶液中进行示差脉冲伏安法DPV信号检测，所得信号用标准曲线法或标准对照法即可得到待检样品中沙门菌的浓度。

2.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述步骤1中金电极抛光用粒度为0.05μm的氧化铝粉，所述的食人鱼溶液为浓H₂SO₄:H₂O₂，体积比为3:1。

3.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述的巯基标记的捕获探针序列为：5’-SH-(CH₂)₆–TTTTTT TTTAATACC GGCCTTCAAATCGGCATC-3’，用于制备金纳米探针的用巯基标记的信号探针序列为：5’-SH-(CH2)6-TTTTTTTCAGAACTCACCTGTTAGTTTT TT-biotin-3’，制作环化DNA时所用的待环化模板DNA序列为：5’-p-CTC AGCTGTGTAACAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAAC TGTGAAGATCGCTTATTATG TCCTATC-3′，探针2序列为：5’–AATACTCATC TGTTTACCGGGCATAAAAAAAAACACAGCTGAGGATAGGACAT-3’。

4.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述步骤3至6中金电极的冲洗按照如下步骤完成：先用含0.005%吐温20的Tris-HCl缓冲液冲洗三次，然后再用Tris-HCl缓冲液冲洗三次，Tris-HCl缓冲液为含有0.1M氯化钠、5mM氯化镁、20mM Tris-HCl，pH7.4。

5.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述步骤3中的鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液按浓度为10mg/ml的鲑鱼精DNA与2%BSA体积比为1:80混合配制。

6.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述步骤5中的滚环扩增反应液中含50mM Tris,10mM氯化镁,33mM醋酸钾,1mM二硫苏糖醇,0.1%吐温-20，pH7.5。

7.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述步骤6中的2×SSC杂交液为含有0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸三钠,pH7.4；所述DEA缓冲液为含有0.1M二乙醇胺，1mM氯化镁，100mM氯化钾,pH9.6。

8.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:沙门菌特异性的invA基因检测的线性范围为100aM～10pM，最低检测限为：100aM。