[发明专利]基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种沙门菌基因的检测方法，尤其涉及一种基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，属于生物检测领域。

背景技术

沙门氏菌属肠杆菌科,是革兰阴性肠道杆菌，它是食源性疾病中最重要的致病菌之一。沙门氏菌感染后主要引起食物中毒、胃肠炎、伤寒和副伤寒。有研究表明，沙门氏菌的侵袭蛋白与其致病性密切相关，决定着细菌进入宿主上皮细胞的能力。它主要由一系列基因编码，其中invA是编码沙门菌侵染上皮细胞表面蛋白的基因，与该菌致病性密切相关，是沙门菌特有的。

目前，最常用的肠道致病菌检测方法主要有三种：传统的分离培养鉴定、酶联免疫吸附法（ELISA）和聚合酶链式反应（PCR）。传统的分离培养鉴定法是将细菌分离培养后通过菌落计数和菌落形态、染色特征、生化反应等方法对细菌进行鉴定，该方法是细菌鉴定的金标准方法，但是其耗时费力。ELISA方法是基于抗原抗体反应的免疫学检测，与传统的分离培养鉴定方法相比较，缩短了检测时间，但是仍然需要细菌培养这一步，至少需要24～48小时才能得出准确的结果，而且该方法的检测限一般为≥10⁵CFU mL^-1，难以满足低浓度细菌的检测。PCR技术与上述两种方法相比较，优点是较高的灵敏度，但是PCR结果容易出现假阳性；目前实验室主要用凝胶电泳技术来检测PCR扩增的片段，但是凝胶电泳技术的分辨率较低且需要较高精确度的热循环仪，因此限制了PCR技术在实验室检测细菌的广泛运用。另一方法，不使用热循环仪的核酸依赖的扩增（NASBA）和自主序列复制系统（ASR）,在特异性上又大打折扣，主要是由于必须用一个相对较低的温度40℃来进行扩增。链置换扩增术（SDA）利用四种引物在等温条件下扩增,很大程度上克服了这些缺陷，但是仍然存在薄弱的环节：必须利用昂贵的修饰核苷酸作为底物来进行扩增反应。

生物学研究领域中经常遇到一些不能直接扩增的待测分子，且由于其浓度较低而无法检测，因而信号放大技术对不能进行直接扩增的低浓度待测分子的检测显得尤为重要。核酸分子体外扩增是生物技术研究的重要手段，如用于病毒检测和遗传病点突变检测方面的连接酶链式反应（LCR）、支链DNA信号放大系统（bDNA）和侵染探针技术（Invader）；用于快速准确检测和定量分析RNA的NASBA和转录介导的扩增（TMA）；用于检测目的DNA片段的Qβ复制等。目前为止，聚合酶链式反应（PCR）和滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）仍是使用较多的扩增技术。RCA是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物（与部分环状模板互补），在酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复模板片段。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。RCA技术的优势是：高灵敏度、高特异性、简单、易操作、多元性、高通量。

纳米颗粒是一种人工合成的微小颗粒，它的形态可能是乳胶体、聚合物、陶瓷颗粒、金属颗粒和碳颗粒。1996年，Mirkin等人(Mirkin，C.A.，et al；)发现表面修饰有核酸探针的13nm金颗粒溶液中加入与修饰核酸互补配对的目标核酸分子时，由于金颗粒聚集导致溶液的颜色由红变蓝。自此利用纳米颗粒来进行生物分子检测的研究得到广泛应用。目前通用的方法主要分为两种，一种是利用在金或银纳米颗粒修饰核酸探针，根据溶液的颜色变化来检测目标核酸分子，优点是检测方法简单，但是所用的纳米颗粒成本较高；另一种是利用在颗粒表面修饰核酸分子，通过不同的核酸扩增手段后加入荧光探针来进行目标分子检测，优点是检测的灵敏度高，但是荧光探针的成本也较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于构建快速和超灵敏检测沙门菌invA基因的方法，选用沙门菌高度保守的invA基因，设计与其特异性结合的探针，利用滚环扩增与金纳米技术，用电化学策略检测沙门菌，提供一种检测设备小型化、简便快速、灵敏度高、检测成本低的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，包括以下步骤：

1）将裸金电极抛光,洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10～15min，再取出清洗、干燥；

2）将巯基标记的捕获探针滴加于上述金电极上，置于4℃冰箱中过夜；