[发明专利]一种乙酰木聚糖酯酶基因(Auaxe)的克隆及重组酶的制备

权利要求书

1.一种来源于Aspergillus usamii E001的新型乙酰木聚糖酯酶，其核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

2.A.usamii E001新型乙酰木聚糖酯酶基因序列克隆及表达的方法：

(1)从已报道的Aspergillus niger CBS513.88基因组信息中找出编码黑曲霉乙酰木聚糖酯酶的完整DNA序列，然后对该序列进行开放读码框分析和信号肽预测，根据预测的结果设计一对特异性引物，引物序列如下：

Auaxe-F：5′-CTCGAGAAAAGAAGTGGTAGCCTCCAACAAATC-3′，含有Xho I酶切位点；

Auaxe-R：5′-GCGGCCGCTCAAGCAAACCCAAACCACT-3′，含有Not I酶切位点；

提取A.usamii E001的总RNA，按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)说明书进行RT-PCR扩增；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-Auaxe)，转化大肠杆菌JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到AuAxe成熟肽cDNA序列；

(2)将测序结果正确的pUCm-T-Auaxe与pPIC9K^M质粒均用Xho I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K^M-Auaxe(图1)，并对重组质粒进行序列测定；

(3)GS115/Auaxe的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sal I对pPIC9K^M-Auaxe进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Auaxe；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用分光光度吸收法测定重组乙酰木聚糖酯酶活性达24.6IU/mI。