[发明专利]一种乙酰木聚糖酯酶基因(Auaxe)的克隆及重组酶的制备

说明书

技术领域

本发明涉及来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的一种新型乙酰木聚糖酯酶(AuAxe)成熟肽cDNA序列的克隆及表达，属于生物工程技术领域。

背景技术

纤维素、半纤维素和木质素是植物细胞壁的主要成分，而木聚糖是植物半纤维素的重要组成部分，它是继纤维素之后含量第二丰富的可再生生物资源。木聚糖酶是降解木聚糖的一组酶的总称，由于木聚糖的来源不同，其结构的复杂性也不同，它的完全降解需要多种水解酶的参与共同完成，如木聚糖酶(xylanase)、β-D-木糖苷酶(β-D-xylosidase)、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase)、乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase)和阿魏酸酯酶(femlic acid esterase)等。乙酰木聚糖酯酶可以把被乙酰化的木聚糖中木糖残基C-2和C-3位上的O-乙酰取代基团水解掉，它能有效地消除乙酰基团对木聚糖酶作用时的空间阻碍作用，从而增强木聚糖酶在降解木聚糖时的亲和力和降解力。乙酰木聚糖酯酶作为半纤维素酶系成员之一，在提高纤维资源的生物降解性，开发为饲料酶制剂投入工业化生产及生物方面显示出良好的效果。随着九十年代初对该酶存在于真菌纤维素和半纤维素降解系统中的报道，通过对重组乙酰木聚糖酯酶酶学性质的研究发现，在缺乏乙酰木聚糖酯酶时，木聚糖酶难以接近高度酰化的木聚糖的主链骨架；添加乙酰木聚糖酯酶时，可以明显改善木聚糖的溶解性和降解速度，它与其他木质纤维素降解酶的协同作用已逐步得到认可。至今为止，国内外对这种酶的研究也鲜见报道。因此，克隆一些具有优良性质的木聚糖降解酶基因具有重要的意义。

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来发展起来的真核表达系统，其不仅具有大肠杆菌繁殖快、易于培养、遗传操作简单和易于工业化生产等原核生物的特点，还具有真核生物基因表达调控和蛋白修饰功能，如糖基化、蛋白磷酸化等，避免了产物形成包涵体，活性降低等问题。基于以上原因，毕赤酵母是表达乙酰木聚糖酯酶较好的系统之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种源于A.usamii E001的新型乙酰木聚糖酯酶成熟肽cDNA序列的克隆及表达的方法，为助于木聚糖酶充分降解木聚糖奠定了基础。根据氨基酸序列的相似性，目前为止，乙酰木聚糖酯酶分布于14个碳水化合物酯酶家族(carbohydrate esterase family，CE)中的7个家族，CE1-CE7。A.usamii E001分泌的乙酰木聚糖酯酶，命名为AuAxe，其相应的基因命名为Auaxe。

A.usamii E001菌株由江南大学筛选和保藏，已于2005年在《食品与发酵工业》杂志的Vol.31，No.4，Pg.50公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。

本发明的技术方案：一种源自A.usamii E001的新型的乙酰木聚糖酯酶(AuAxe)，其cDNA核苷酸序列为SEQ IDNO：1。

所述的由成熟肽cDNA序列所推导的AuAxe氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

所述的重组乙酰木聚糖酯酶的活性测定方法：

以对硝基苯酚醋酸酯为底物测定重组乙酰木聚糖酯酶的活性，取0.2mL100mM的底物(DMSO溶解)与4.7mL100mM的磷酸缓冲液(pH6.0)混匀，加入0.1mL稀释适当倍数的酶液，50℃下准确反应2min后加入2mL甲醇终止反应，测定OD₄₁₀。在上述反应条件下，每分钟产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活性单位(IU)。

所述的Auaxe成熟肽cDNA序列的克隆和表达的方法如下：

(1)从已报道的Aspergillus niger CBS513.88基因组信息中找出编码黑曲霉乙酰木聚糖酯酶的完整DNA序列，然后对该序列进行开放读码框分析和信号肽预测，根据预测的结果设计一对特异性引物，引物序列如下：

Auaxe-F：5′-CTCGAGAAAAGAAGTGGTAGCCTCCAACAAATC-3′，含有Xho I酶切位点；

Auaxe-R：5′-GCGGCCGCTCAAGCAAACCCAAACCACT-3′，含有Not I酶切位点；