[发明专利]一株产角蛋白酶的短小芽孢杆菌及其应用方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产角蛋白酶的短小芽孢杆菌及其粗酶性质。

背景技术

角蛋白广泛存在于自然界中，主要以动物毛发、羽毛、蹄角为主要存在形式，是一种很难降解的硬性蛋白，角蛋白酶作为一种能专一性降解角蛋白的酶类，在角蛋白废弃物再利用上具有广泛的应用前景。

我国的废次羊毛和家禽羽毛资源极其丰富，其主要成分是难被降解的角蛋白。目前这些优良的蛋白资源大部分未被有效利用，造成了资源浪费，有的甚至造成环境污染。角蛋白酶具有特异性降解角蛋白的特性，可将角蛋白转变成可溶性蛋白、氨基酸等，广泛应用于皮革工业、医药原料、动物饲料等。能产生角蛋白酶的微生物种类很多，如芽孢杆菌、链霉菌、单胞菌、真菌等。

本发明的目的在于提供一株产角蛋白酶的短小芽孢杆菌，并对其粗酶性质进行了研究。

发明内容

角蛋白酶产生菌株的筛选、鉴定方法为：

（1）初筛：土壤样品采集地点为江南大学附近农村羊圈，以羊毛为唯一碳氮源进行平板初筛，将所采土样制备土壤悬液，逐级稀释涂布至初筛平板，置于30℃培养箱中培养3天。挑取能在羊毛为唯一碳氮源的初筛平板上生长的单菌落，稀释涂布至得到单菌落。

（2）复筛：将初筛得到的菌株接种至羊毛为唯一碳氮源的摇瓶发酵培养基，培养至合适时间，检测发酵上清液角蛋白酶活力，得到酶活较高的菌株。

（3）菌株的分子鉴定：对菌株进行16S rDNA鉴定。方法为：提取菌株总DNA，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到基因序列为1500 bp左右的16S rDNA序列，与Genbank数据库进行序列比对，结果为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，并将其命名为K9，于2013年08月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8046。

上述初筛培养基（g/L）：羊毛粉5，琼脂粉20，NaCl 0.5，K₂HPO₄ 0.4；

上述复筛摇瓶发酵培养基（g/L）：羊毛粉10， NaCl 0.5， K₂HPO₄ 0.4。 

优化培养条件方法：

培养条件优化采用了单因素及正交实验，优化了菌株的发酵培养基及发酵条件，结果得到最适培养基配方为羊毛1-3%，麦芽糖1-2%，酵母粉1-2%，磷酸氢二钾0.04%，氯化钠0.05%，培养条件为：初始pH值为8.5，接种量8%，培养温度35℃，转速220r/min，装液量25ml/250ml，发酵周期48h，产角蛋白酶活力达到214.5U/ml。

粗酶性质研究：

在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃条件下测定酶活，结果表明该角蛋白酶的最适作用温度为55-65℃范围内。配制不同pH值（3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）的缓冲液测定pH对该酶活力的影响，得到结果为最适pH 为9.0，且所产角蛋白酶在碱性环境(pH8.0-11.0)中酶活都比较稳定。

角蛋白酶活力的测定方法：

将发酵液离心得到发酵上清液，取1.0mL发酵上清液，加入1.0mL 0.05mol/L的Tris-HCl ( pH=9.0 )缓冲液和10mg羊毛粉底物，于55℃恒温振荡水浴锅中反应1h，加入0.4mol/L三氯乙酸2.0mL终止反应，12000rpm离心15min，取上清液于280nm处测定其吸光值。以反应前添加三氯乙酸处理作为对照。

酶活定义为：在上述反应体系中，280nm处吸光值增加0.01为1个酶活力单位(U/mL)。     

具体实施方式

实施例1 角蛋白酶产生菌株的筛选与鉴定

1、实验材料

土样来源：江南大学附近农村羊圈采集的土壤样品。

平板初筛培养基(g/l)：羊毛粉5，琼脂粉20，NaCl 0.5，K₂HPO₄ 0.4。

LB 培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。

发酵培养基(g/l)：羊毛粉10，NaCl 0.5，K₂HPO₄ 0.4

2、平板初筛