[发明专利]膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法

权利要求书

1.一种膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法，包括如下步骤：

设计含酶切位点EcoRI的引物pLVX-PD-1-F和含酶切位点BamHI的引物pLVX-PD-1-R，并所述药物与PD-1的DNA序列进行PCR扩增，收集扩增产物；

将慢病毒包装质粒载体pLVX-IRES-ZsGreen1与所述扩增产物分别进行酶切处理，分别得到pLVX-IRES-ZsGreen1（EcoRI+BamHI）和PD-1（EcoRI+BamHI）酶切产物；所述pLVX-IRES-ZsGreen1（EcoRI+BamHI）和PD-1（EcoRI+BamHI）酶切产物连接后转化处理，将转化产物扩增后进行质粒抽提处理，得到膜表达PD-1的载体pLVX-PD-1-IRES-ZsGreen1；

将所述膜表达PD-1的载体pLVX-PD-1-IRES-ZsGreen1与病毒包装质粒pMD2.G和PsPAX₂共转染至真核细胞中，进行病毒包装，同时对病毒滴度进行监控；

当病毒滴度以MOI=2～10感染所述真核细胞时，加入终浓度为5-8ug/ml的polybrene协助病毒；将感染病毒的所述真核细胞进行正常传代后，选取荧光阳性（细胞进行分选，并对分选的细胞进行扩增后冻存处理，得到稳定表达PD-1的细胞株。

2.如权利要求1所述的膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法，其特征在于，在构建载体pLVX-PD-1-IRES-ZsGreen1的步骤中，所述引物pLVX-PD-1-F序列为：5'-CCGGAATTCATGCAGATCCCACAGGCG-3’；所述引物pLVX-PD-1-R序列为：5'-CGCGGATCCTCAGAGGGGCCAAGAGCAGT-3'。

3.如权利要求1所述的膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法，其特征在于，在所述稳转株构建的步骤中，所述荧光强度通过使用流式细胞仪对病毒自带荧光蛋白ZsGreen进行检测获得。

4.如权利要求1～3任一所述的膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法，其特征在于，所述构建载体pLVX-PD-1-IRES-ZsGreen1的步骤中，所述PD-1的DNA序列进行PCR扩增处理的扩增体系为：

5.如权利要求1～3任一所述的膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法，其特征在于，所述构建载体pLVX-PD-1-IRES-ZsGreen1的步骤中，所述PD-1的DNA序列进行PCR扩增处理的方法为：

第一阶段：95-98℃/2-3min；

第二阶段：95-98℃/25-35s，58-62℃/25-35s，68-74℃/25-35s，共30-35个循环；

第三阶段：68-74℃/8-12min，10℃保存。

6.如权利要求1-3任一所述的膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法，其特征在于，所述构建载体pLVX-PD-1-IRES-ZsGreen1的步骤中，所述将慢病毒包装质粒载体pLVX-IRES-ZsGreen1进行酶切的酶切体系如下：

7.如权利要求1-3任一所述的膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法，其特征在于，所述构建载体pLVX-PD-1-IRES-ZsGreen1的步骤中，所述PD-1的DNA的PCR产物酶切体系如下：

8.如权利要求1-3任一所述的膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法，其特征在于，所述构建载体pLVX-PD-1-IRES-ZsGreen1的步骤中，连接pLVX-IRES-ZsGreen1和PD-1的连接体系如下：

9.如权利要求1-3任一所述的膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法，其特征在于，在进行所述质粒抽提处理前，还包括对转化产物进行小量质粒抽提、抽样鉴定、测序处理，其中，所述鉴定处理的鉴定体系为：

10.如权利要求1-3任一所述的膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法，其特征在于，在对所述转化产物进行质粒抽提处理后，还包括对抽提到的质粒进行蛋白表达鉴定处理，所述蛋白表达鉴定处理的步骤将抽提到的质粒去内毒素后转染真核细胞，转染48-72h后收集细胞进行蛋白抽提，对抽提蛋白使用Western Blot鉴定蛋白表达。