[发明专利]膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法。

背景技术

程序性细胞死亡蛋白1（Programmed cell death protein1，以下简称PD-1）是由PDCD1基因也叫CD279基因编码的蛋白，为免疫球蛋白超家族中的细胞膜蛋白成员之一，是典型的由268个氨基酸组成的I型膜蛋白。PD-1是CD28/CTLA4家族中的T细胞调节因子之一，其结构包括一个胞外的IgV结构域，其后紧跟着一个跨膜结构域和一个胞内末端。PD1最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中得到的，由于其和细胞凋亡相关而被命名为程序性死亡-1受体。PD-L1与其T细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答负调控方面发挥着重要作用，该分子具有广泛的组织表达谱，在一些肿瘤细胞系上有较高的表达，许多研究均表明其于肿瘤的免疫逃逸机制相关。肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，且广范表达，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡。因此通过阻断PD-L1/PD-1信号通路可有效抑制肿瘤生长，可根据此设计新的对肿瘤免疫逃逸的治疗方案，来加强T细胞对肿瘤的杀伤作用。

在抗肿瘤免疫中，通常遵循肿瘤特异性T细胞活化、T细胞增值、肿瘤浸润和T细胞记忆应答加强的步骤。研究表明，肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的APCs表达的PD-L1均可经PD-1/PD-L1信号通路抑制肿瘤抗原特异性T细胞的活化，下调T细胞介导的肿瘤免疫应答，干预PD-1/PD-L1信号有望成为肿瘤免疫治疗的新策略。

目前，构建稳定表达细胞系有两种方法：

1）抗生素筛选：该种方法的构建稳定表达细胞系的基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，将目标基因构建至带有抗生素筛选标记的质粒上，载体在通过磷酸钙转染、脂质体转染或者电转等方式转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体所含的抗生素标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素（puromycin），用长G418来代替新霉素进行选择性筛选，筛选得到可稳定表达的目的蛋白的细胞株。但其筛选时间长，且受限于所采用的转染方式和相应的细胞系，对于某些不能转染长期培养的原代细胞和难转染的细胞将不适合采用这种方法，且转然效率的高低直接影响整合发生的概率，而且假阳性发生率高，细胞在长期的抗生素培养基中容易产生抗药性，后续细胞筛选鉴定工作量大。

2）慢病毒感染后筛选：慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体带有可进行高效率的包装、转染并稳定整合进靶细胞的基因组中的序列元件，目的基因参与细胞的基因重组，形成稳定遗传物质，使得目的基因在细胞中可稳定长期表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。慢病毒感染细胞后能很快将目的基因随机整合至基因组中，整合效率高，假阳性少等优点。且其筛选标记物可扩展到各类荧光蛋白标记的非抗生素标记物，如EGFP，RFP，YFP，ZsGreen1等，在后续的筛选中可轻易通过流式细胞仪进行识别和筛选，无需加入流式抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法，旨在解决现有技术单克隆抗体生产株假阳性发生率高、亲和力不高、单克隆筛选时间长和筛选成本高的问题。

本发明是这样实现的，一种膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法，包括如下步骤：

设计含酶切位点EcoRI的引物pLVX-PD-1-F和含酶切位点BamHI的引物pLVX-PD-1-R，并所述药物与PD-1的DNA序列进行PCR扩增，收集扩增产物；

将慢病毒包装质粒载体pLVX-IRES-ZsGreen1与所述扩增产物分别进行酶切处理，分别得到pLVX-IRES-ZsGreen1（EcoRI+BamHI）和PD-1（EcoRI+BamHI）酶切产物；所述pLVX-IRES-ZsGreen1（EcoRI+BamHI）和PD-1（EcoRI+BamHI）酶切产物连接后转化处理，将转化产物扩增后进行质粒抽提处理，得到膜表达PD-1的载体pLVX-PD-1-IRES-ZsGreen1；