[发明专利]微波辅助蛋白酸水解快速制备小肽氨基酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微波辅助蛋白酸水解快速制备小肽氨基酸的方法，属于蛋白质的加工技术领域。

背景技术

蛋白质水解产物为胨、肽等，最终产物为α-氨基酸。肽是由一定数量的氨基酸通过肽键相连而成的，一般把肽键中氨基酸数为2～20个的肽称为寡肽或小肽，而将肽链长度大于20个氨基酸称为多肽。近代研究表明，蛋白质吸收的主要形式不是以氨基酸而是以小肽的形式完整吸收，小肽转运系统具有速度快、耗能低和不易饱和等特点，以肽的形式吸收的氨基酸强度比以游离氨基酸混合物吸收的强度高出70%～80%，其可以直接通过小肠壁进入血液，进而影响动物体内蛋白质代谢。肽作为动物消化道蛋白质的主要酶解产物，是迅速吸收的氨基酸供体，同时释放的许多肽具有活性作用，能够调节机体的生命活动。小肽能完整地通过肠粘膜细胞进入体循环，直接参与组织蛋白质的合成。某些具有特殊生理活性的小肽能够参与机体生理活动和代谢调节，提高动物机体的免疫能力。由于小肽结构的被阐明，生物技术、化学合成和基因工程的发展，小肽的生产和工艺有了许多改进和创新。小肽与氨基酸运输体系相比，小肽转运速度快、耗能低、吸收机制本身不易饱和，且可避免氨基酸之间的吸收竞争。目前，国内外生产小肽的方法主要有化学合成法、酶解法、酸水解法和碱解法、微生物发酵法和DNA重组技术。化学合成法分为液相法和固相法。液相法不适合反应中间体溶解度较低的情况。固相法与液相法相比易于纯化，可以实现自动化，但由于成本高，极大地限制了其应用。化学合成法的局限性主要表现在肽键形成中存在消旋作用，保护和去保护操作繁琐，使用超过量的偶联剂和酰化试剂回收困难，溶剂及偶联剂的毒性会带来环保及健康方面的问题；酶解法生产小肽是以蛋白质原料为底物，运用蛋白酶的酶解内剪切作用生产小肽，肽含量和可溶物含量高，营养较好，价格低廉，与小肽酶解生产效果密切相关的因素主要包括温度、pH值、酶浓度、底物浓度、酶解时间等。在一系列的研究中。酶解的最适宜条件确定困难，即使针对相同的酶解底物，可能结果也不一致；缺点是生产周期长，“三废”多，水解度和酶解过程的重复性难以控制，特别是任何酶制剂和酶解条件都不可避免使产品带有严重苦味，影响动物采食量。酸水解法和碱解法指在仅酸或碱存在的条件下使蛋白质发生分解产生小肽的一种方法。由于碱水解时，丝氨酸和苏氨酸等大部分氨基酸被破坏，且会发生消旋作用，营养成分损失大；酸水解蛋白质不会引起氨基酸的消旋作用，水解速度快、反应完全彻底，但温度和时间对水解程度影响很大，且所得水解产物中含大量因中和反应而产生的盐。总的来说，酸水解法和碱解法多用于试验研究，而在生产实践中使用较少；微生物发酵法能较好地去除蛋白质原料中的抗营养因子，生产成本低，发展前景较好。此方法的关键是筛选出合适的菌种，分泌合适的蛋白酶，在体外将蛋白质切成长短合适的肽段。为了提高小肽的产量和品质，还应注意底物的组成、菌龄、接种量、发酵时间等因素的影响；DNA重组技术是指从动物或植物的基因组中分离出带有目的基因的DNA片段，然后将此DNA片段克隆至适当的载体，并采用特定方法将其导入受体细胞，通过细胞表达获得所需要的活性肽或将外源基因插入到噬菌体基因序列之中，使得多肽以融合蛋白形式表达在噬菌体颗粒表面，并经过加工、纯化获得所需要的小肽。DNA重组技术目前仅限于生产大分子活性多肽和蛋白质的生产，在小分子的基因片段操作困难、其表达效率较低、监测工作困难、难筛选到高效表达的菌株和产量较低，另外生产小肽的种类也受限制。

发明内容

本发明针对现有技术中蛋白水解存在的各种弊端，目的在于提供一种在温和条件下用微波辅助蛋白酸水解快速制备小肽氨基酸的方法，该方法成本低，周期短，可以工业化生产。

本发明提供了微波辅助蛋白酸水解快速制备小肽氨基酸的方法，该方法是在功率为150～800W的微波环境中，将变性蛋白原料加入到盐酸和亚硫酸混合液中，在80～120℃进行水解反应4～8h；水解反应完成后，将反应液离心过滤，纳滤膜脱酸，超滤分离，得到不同分子量的小肽氨基酸；其中，变性蛋白原料与盐酸和亚硫酸混合液的质量比为1:4～5；所述的盐酸和亚硫酸混合液由质量百分比浓度为10～25%的盐酸溶液和质量百分比浓度为5.5～6.5%的亚硫酸溶液按体积比1:1～1.5混合得到。

所述的盐酸和亚硫酸混合液由盐酸溶液和亚硫酸溶液按优选的体积比1:1～1.2混合得到。

所述的水解反应由TCA法跟踪测定水解率来确定反应时间；水解率和时间成正比，