[发明专利]使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法

权利要求书

1.一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

一、配制试剂：

（1）配置FITC浓储液：

 将FITC粉末中加入DMSO，使其终浓度为0.5M，分装后避光在-20℃保存，使用期限为1年；

（2）配置MITO浓储液：

 将MITO粉末中加入DMSO,使其终浓度为0.069mM/L，分装后避光在-20℃保存，使用期限为1年；

     （3）配置staining talp精子染色缓冲液：

                HEPES                   40mM/L

                  氯化镁                   0.4mM/L 

                  氯化钠                   95mM/L  

                  氯化钾                   3mM/L

                  磷酸氢二钠               0.3mM/L

                  碳酸氢钠                 10mM/L

                  丙酮酸钠                 2mM/L 

               葡萄糖                   5mM/L

                  乳酸钠                  25mM/L

                  牛血清白蛋白            3g/L           

                  超纯水                  其余为超纯水；

     二、精子染色：

（1）精子FITC染色：

     ①取500万精子加入5ml的staining talp精子染色缓冲液，使精子终浓度为100万/ml；

     ②在步骤①的精子溶液中加入0.75μl的FITC浓储液，使其终浓度为0.077mM/L，轻轻摇动将染色液摇匀；

     ③在37℃避光染色40分，将染色的精子轻轻摇晃；

     ④染色结束后，1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动；

 ⑤1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动；

     ⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250μl staining talp精子染色缓冲液；

（2）精子MITO染色：

①取500万精子加入5ml的staining talp精子染色缓冲液，使精子终浓度为100万/ml；

②在步骤①的精子溶液中加入1.81μl的MITO浓储液，使其终浓度为3.45×10^-5mM/L，轻轻摇动将液体摇匀；

③在37℃避光染色10分；

④染色结束后，1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动；

⑤1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动；

⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250μl staining talp精子染色缓冲液；

（3）精子混合：

将步骤（1）用FITC染色后的精子与步骤（2）用MITO染色后的精子等量混合，放在37℃，3h；

（4）检测：

①对步骤（1）用FITC染色后的精子、步骤（2）用MITO染色后的精子进行荧光检测；

②对步骤（3）FITC染色后的精子与MITO染色后的精子等量混合后3h 的混合精子进行荧光检测 。