[发明专利]使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法

说明书

技术领域

本发明属于一种精子鉴定方法，特别涉及一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法。 

背景技术

不同物种的精子从形态上具有一定差别，可以通过形态进行辨别，但有些物种的精子形态相近、大小、精头部轮廓、尾部的长度仅仅通过显微镜进行辨别具有一定难度，特别是将两种精子混合后很难再区分彼此。目前对于形态相近的精子最好的方法就是通过不同的颜色进行辨别。将不同精子用不同染料染色后混合，可以通过各自的颜色来区分不同的精子，但荧光染料品种很多，由于染料没有特异性，因此混合后的不同精子染色后极易发生串色现象，串色后染成不同颜色的精子就变成同样颜色无法区分；有的对精子活力有影响；有的荧光持续时间短。为此，需要寻找出一种即能不影响精子活力，又可以不串色的将形态相近、无法通过显微镜进行区别的精子进行辨别的方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，该技术原理是利用FITC可以与精子膜蛋白结合发出黄绿色荧光，MITO与精子线粒体结合发出红色荧光，FITC与MITO对精子活力均无影响，两种不同精子用两种染料各自染色后混合在荧光下可区分两种精子。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，其特征在于：它包括以下步骤： 

一、配制试剂： 

（1）配置FITC浓储液： 

将FITC粉末中加入DMSO，使其终浓度为0.5M，分装后避光在-20℃保存，使用期限为1年； 

（2）配置MITO浓储液： 

将MITO粉末中加入DMSO,使其终浓度为0.069mM/L，分装后避光在-20℃保存，使用期限为1年； 

（3）配置staining talp精子染色缓冲液： 

二、精子染色： 

（1）精子FITC染色： 

①取500万精子加入5ml的staining talp精子染色缓冲液，使精子终浓度为100万/ml； 

②在步骤①的精子溶液中加入0.75μl的FITC浓储液，使其终浓度为0.077mM/L，轻轻摇动将染色液摇匀； 

③在37℃避光染色40分，将染色的精子轻轻摇晃； 

④染色结束后，1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑤1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250μl staining talp精子染色缓冲液； 

（2）精子MITO染色： 

①取500万精子加入5ml的staining talp精子染色缓冲液，使精子终浓度 为100万/ml； 

②在步骤①的精子溶液中加入1.81μl的MITO浓储液，使其终浓度为3.45×10^-5mM/L，轻轻摇动将液体摇匀； 

③在37℃避光染色10分； 

④染色结束后，1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑤1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250μl staining talp精子染色缓冲液； 

（3）精子混合： 

将步骤（1）用FITC染色后的精子与步骤（2）用MITO染色后的精子等量混合，放在37℃，3h； 

（4）检测： 

①对步骤（1）用FITC染色后的精子、步骤（2）用MITO染色后的精子进行荧光检测； 

②对步骤（3）FITC染色后的精子与MITO染色后的精子等量混合后3h的混合精子进行荧光检测。 

本发明的有益效果是：在不影响精子活力的条件下，只通过两种荧光染光就可将形态相近的精子在一定时间内区分出来。 

1、使用这两个荧光染料都不影响精子的活力