[发明专利]一种诱导心肌细胞凋亡的β1肾上腺素受体单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明属于免疫学领域，涉及一种新型的导心肌细胞凋亡的β1肾上腺素受体单克隆抗体。

背景技术

β₁肾上腺素受体自身抗体是一种针对β₁肾上腺素受体细胞外第二环产生的自身抗体，它主要存在于扩张性心肌病、恰加斯病以及心衰等多种心血管疾病中。研究发现，β₁肾上腺素受体自身抗体对于研究心血管疾病的免疫学机制具有重要意义，且该自身抗体可以直接诱导心肌细胞发生凋亡(Daniel Jane-wit等，Beta1-adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.Circulation.2007；116：399-410.)。以往的研究中运用的自身抗体多为从血清中获得的多克隆抗体。通过纯化抗体分子可提高多克隆抗体的滴度。根据抗体与靶分子的相互作用，将抗体从蛋白质混合物中分离出来。

已经有人采用MAb Trap Kit试剂盒，从β1-AA为阳性的血清中提纯总IgG，虽然其中以抗β₁-AR抗体为主，并可以通过β₁-AR特异性阻断剂metoprolol和人工合成的β₁-AR-EC_II抗原肽段间接验证效应主要是由抗β₁-AR抗体引起(Antonio S.Tutor等.2007.Anti-β1-adrenergic receptor autoantibodies are potent stimulators of the ERK1/2 pathway in cardiac cells.Cardiovascular Research76：51-60.)。该方法提纯的抗体为血清中总的IgG，并不是特异针对β₁肾上腺素受体细胞外第二环，无法排除其他IgG的干扰。

还有一种方法从血清中提纯总的IgG，经过挂有β₁-AR-EC_II抗原肽段的特异性亲和柱，以便提纯血清中高纯度的抗β₁-AR抗体(Wallukat G等1995.Anti-beta1-adrenoceptor autoantibodies with chronotropic activity fromthe serum of patients with dilatedcardiomyopathy：mapping of epitopes inthe first and second extracellular loops.J Mol Cell Cardiol.27(1)：397-406)。通过此方法虽能得到特异性针对β₁-AR-EC_II的抗体，但得到的β₁-AA的浓度过低无法进行后续实验，且经济成本太高，因此，该技术应用并不广泛。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本发明构建一种针对β₁-AR细胞外第二环并且与心衰患者血清中的β₁-AA具有相同生物学效应的新型β₁-AA单克隆抗体。

该新型β₁-AA单克隆抗体通过以下方法获得：首先设计合成抗原肽段，并将肽段进行偶联；免疫小鼠，获得血清；监测血清，制备单克隆杂交瘤细胞株；筛选特异性单克隆抗体，选取杂交瘤细胞株扩大培养，接种小鼠，收集腹水并Protein G纯化。

该抗体以单一的亲和性和特异性与β₁肾上腺素受体细胞外第二环结合，可有效排除其他抗体的干扰，并且与临床病人血清中存在的β₁-AA具有相同的生物学效应。因此，使用该单克隆抗体进行科学研究可以得到更可靠的实验结果。

本发明使用了两条肽段进行免疫，其中多肽1段为β₁肾上腺素受体细胞外第二环的氨基酸序列，但免疫原性较低；而多肽2段为针对多肽1段设计的免疫原性较高的肽段。因此，用这两条肽段分别免疫，在保证获得正确抗体的同时也提高了免疫原性。

针对β1肾上腺素受体细胞外第二环、且与临床病人血清中存在的β₁-AA具有相同的生物学效应的单克隆抗体首次制备成功。

附图说明