[发明专利]链球菌AUH-JLD109及其在柚皮素生物合成中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物及其应用。

背景技术

柚皮素（Naringenin）是二氢黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、抗癌、抗高血糖、抗氧化、解痉孪和利胆等多种生理或药理功能。早在上世纪90年代人们就曾认识到柚皮素具有抗癌功效，如Guengerich等于1990年报道柚皮素而非柚皮苷能抑制黄曲霉毒素B1诱导的致癌作用(Carcinogenesis，1990，, 11:2275-2279)；Chen等于2003年发现，较低浓度的柚皮素（40微摩尔/升）即可引起白血病细胞系HL-60细胞发生凋亡，且表现出明显的量效关系和时间依赖性；与葡萄糖和鼠李糖结合的柚皮素（即柚皮苷）在相同浓度下甚至更高浓度（80微摩尔/升）下仍不表现明显的细胞凋亡作用，而用柚苷酶处理柚皮苷后又产生明显细胞凋亡作用，这一研究结果再次证明柚皮素而非柚皮苷的抗癌活性（Biochemical Pharmacology，2003，66:1139-1150）。此外，RAZA等用柚皮素预处理雄性小鼠21天后发现，柚皮素可显著减弱局部性脑损伤小鼠模型中的氧化应激以及受NF-KB调节的炎症进程（Neuroscience，2013，230:157-171）。Ortiz-Andrade等发现柚皮素具有体内外抗高血糖活性（Diabetes, Obesity and Metabolism，2008，10:1097-1104）。我国学者廖霞等曾报道柚皮素对凝血酶诱导的血小板聚集有明显抑制作用，且该抑制作用随浓度的增加而增大 (时珍国医药，2010，21（11）:2909-2910)。

柚皮素为天然产物，但因在天然植物中含量较低，直接从植物中提取分离柚皮素的收率也较低。如陈雪峰等采用传统有机溶剂法从桃叶中提取柚皮素， 通过试验确定柚皮素最佳提取条件为: 乙醇和甲醇混合溶剂（浓度比为甲醇:乙醇=7:3），温度为50℃，时间为5小时，料液比为1:45(克/毫升)，然而在该最佳提取条件下柚皮素的收率仅为5.25%（食品科技，2009，34(5):209-212）。与柚皮素相比，柚皮苷（即与葡萄糖和鼠李糖结合的柚皮素）则在柑橘属植物中分布广泛且含量较高。目前柚皮素的工业生产多以柚皮苷为底物，采用酸水解或柚苷酶水解这两种生产方式。刘亚萍（光谱实验室，2008，25(6):1292-1294）提供了酸水解柚皮苷来制备柚皮素的方法，然而，这种方法需多次结晶才能获得纯度较高的柚皮素。专利CN 102453011 A通过酸水解的方法虽获得的柚皮素的纯度较高，但是涉及到的有机溶剂种类多且步骤繁琐，不适合现代化生产绿色环保的要求。2003年Hwang等通过基因工程手段首次以酪氨酸为底物生物合成柚皮素，所设计的3套质粒系统中以第3套的得率最高，所制得的柚皮素约为400微克/升（Applied Microbiology Biotechnology，2003，69(5): 2699-2706)。此后，Leonard于2008年利用重组大肠杆菌以苯丙氨酸为底物，添加外源丙二酸盐诱导，并通过脂肪酸抑制宿主本身丙二酰辅酶A的旁路流失得到186毫克/升的柚皮素（Molecular Pharmaceutics，2008，5(2):257-265)。利用基因工程菌生物合成柚皮素的方法虽简便，但产量低，不适宜规模化生产。此外，酶水解柚皮苷获得柚皮素是目前柚皮素制备的另一主要途径。郑美瑜等（中国食品学报，2010，10(4):141-146）研究证实成品柚苷酶对柚皮苷单体的酶解条件为:酶解液中底物质量浓度为25克/毫升，酶含量为1酶单位/毫升，酶解时间为1.0-1.5小时，此条件下柚皮苷单体可被完全降解。酶法制备柚皮素具有反应条件温和、副产物少、产物纯度高等优点，但成品柚皮苷酶价格昂贵，也同样不适合大规模工业化生产，因此目前急需找到一种廉价高效的生物酶源来代替成品柚皮苷酶制备柚皮素。