[发明专利]一种微藻藻株人工选育方法

说明书

技术领域

本专利属于微藻培养技术领域（C12N1/12），是一种微藻藻株人工选育方法。

背景技术

微藻为自养型微生物，因其细胞内存在光合作用系统也称为微藻植物。微藻具有高效吸收太阳能、固定二氧化碳产生生物质的能力（即光合作用能力）；同时微藻作为微生物的一种，其增殖速度较快。作为单细胞生物，微藻的主要组成为蛋白、脂肪、碳水化合物和核酸等。目前，微藻已经是重要的养殖饵料被养殖企业广泛应用，同时微藻也已经成为类胡萝卜素、蛋白质、多糖等保健食品的来源。随着化石能源枯竭的预期加剧，微藻在能源制品和精细化学品的潜在应用也得到了极大关注。

目前，实际生产应用的藻种多从自然界直接分离获得，后代的性状单一，容易出现对环境的适应能力差以及藻种退化等问题。以传统的方法进行藻种的复壮或重新选育优良藻株，往往需要较长的周期和花费大量的人力。为了获得高产及满足下游炼制需求的藻株，必须改进微藻的育种技术，从而对微藻的种质进行改良。

常压室温等离子体（ARTP）是近几年来发展起来的一种新的等离子体源，能够在常压(1am)下产生温度在25～40℃之间的、具有高活性粒子（如处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）浓度的等离子体射流。科学研究表明，等离子体中适当剂量的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生致畸突变。

常规微藻藻株筛选也是一个耗时较长的工作，因为大多检测方法都是基于获得一定生物量基础上开展的。如，常规的微藻油脂评估至少需要数百毫升微藻藻液，从固体平板至所需要生物量平均需要一个月的培养时间。而同时，诱变筛选可能获得上百个备选藻株，因此，适宜的诱变后筛选技术也是微藻藻株选育的重要一环。

随着各种染色方法灵敏度的提高，利用染色法对微藻生物质进行评估需要生物量大大少于常规方法，为提高筛选提供了可能，如，碘液可以对细胞内的淀粉进行染色，以荧光染料尼罗红可以对细胞内的中性脂进行染色等。

因此，基于上述分析，本发明提出了一种新型微藻藻株人工选育方法，将等离子体诱变与基于染色的快速筛选相结合，具有高效、快速获得目标藻株的特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种微藻藻株人工选育方法。

野生藻株的驯化和改良是微藻工业化生产实现所必需的，为了提高微藻藻株选育的速度，本发明结合了绿色无污染的常压室温等离子体诱变、基于吸光度与特异性荧光染料荧光强度变化的藻株筛选技术，实现目标藻株高效、快速获得的目的。

本发明利用常压室温等离子体对野生藻株进行诱变，即使用室温常压等离子体仪对微藻培养液进行诱变。其中待诱变微藻细胞浓度在100-1000万细胞/毫升，诱变微藻藻液在10～200μL，电源输出功率为50～200W，工作气流量为1～20SLM，等离子体发射源与样品之间距离为1～10mm，放电时间5秒～2分钟。

所述诱变操作结束后，将诱变处理后的微藻涂布于固体培养基上，在选择压力（温度、光强、缺陷培养基）或正常培养条件下进行培养，同时以未诱变处理的藻液作为对照。诱变成功的判定标准：对于正常培养条件下，至藻落生长出后，分别对诱变和对照组进行藻落计数，以致死率=（1-诱变藻落数/对照藻落数）×100%大于或等于90%为成功诱变的指标，对生长出诱变藻落进行96孔板培养筛选；对于选择压力下，生长出的藻落即用于96孔板培养筛选。

所述藻落在96孔板中进行液体培养，利用酶标仪或者具有孔板扫描功能的分光光度计对孔板培养的微藻OD值进行测定，获得藻细胞生长情况。根据不同微藻藻株可选用不同的检测波长，如金藻通常使用650～680nm检测，绿藻通常使用750nm检测。

所述液体培养微藻通过特异性染色剂进行染色，以显色强弱对目标代谢物生产情况进行检测。通常利用碘液对细胞内淀粉进行染色，以荧光染料尼罗红或者BODIPY对细胞内中性脂或者油脂进行染色。

最终，根据筛选目的，结合生长于代谢物生产情况，确定对应的诱变藻株，用于后续研究或生产实践。

本发明是在室温、大气压、低电压环境下使用等离子体对微藻进行诱变，避免了常规物理化学诱变方法的毒性或强细胞损伤，同时处理时间短，诱变处理过程仅有几分钟；利用96孔板培养作为筛选基础，将OD检测与特异性显色反应结合，避免了常规检测过程中需要较长培养时间以获得足量生物质的弊端，同时可对大量藻株进行测定，从藻落到初步筛选出目标藻株的时间缩短至一周左右。因此本发明相对常规微藻藻株选育是一种绿色、高效、快速的新方法。