[发明专利]一种从雷公藤提取物中快速制备雷公藤红素化学对照品的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从雷公藤中快速制备雷公藤红素化学对照品的制备新工艺。主要包括提取与萃取、硅胶柱分离、快速的高效液相制备以及凝胶精制。雷公藤红素的结构式如下：

背景技术

在传统医学中，雷公藤为雷公藤属常用的药用植物，常用于治疗类风湿性关节炎、皮肤发痒、腰带疮和麻风反应。现代药理实验表明雷公藤有抗炎、抗氧化、免疫抑制、抗生育、抗菌、止痛、抗肿瘤等作用。雷公藤红素(tripterine)，又称南蛇藤素(celastrol)，红色针状晶体，为一降碳五环三萜，广泛分布于卫矛科雷公藤属和南蛇藤属药用植物的根部中。雷公藤红素是雷公藤中的主要药效成分之一，药理活性丰富、主要有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抑制血管生成、诱导细胞凋亡等活性，尤其是抗肿瘤活性引起了极大的研究兴趣，具有广泛的开发应用前景。同时雷公藤红素又是雷公藤中一种的毒性成分，因此制备高纯度雷公藤红素对于更深入研究其药理活性及相关药材或中成药的质量控制具有重要意义。

目前，制备雷公藤红素的方法报道较多，提取的方法主要为有机溶剂、超声提取，超临界CO2萃取，纯化的方式基本采用有机溶剂萃取、传统硅胶或氧化铝柱层析，再用混合有机溶剂重结晶(中国发明专利CN101311186A、CN101830960A)；还有用植物组织培养的方法来制备雷公藤红素(美国专利US4328309A)；少量使用反相C18或C8硅胶柱色谱纯化的文献(中国发明专利CN101638425A)；少量使用反相高效制备液相色谱对雷公藤红素提取和纯化的探讨(中南大学硕士论文，陈兰，2010)。在已有的这些方法中，采用重结晶制备的都使用了大量的卤代烃，且纯度不能保证，而采用反相C18或C8硅胶纯化和反相高效制备液相色谱一般为分析规模及半制备规模，制备通量很小。

发明内容

本发明旨在提供一种快速获得高纯雷公藤红素对照品的高效制备工艺，其制备规模达到克级。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：雷公藤药材用乙醇提取，经乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析分离及制备高效液相色谱和凝胶纯化之后，可快速获得纯度大于98%的雷公藤红素化学对照品，其具体步骤如下：

1）提取与萃取：

雷公藤药材，粉碎，用乙醇溶液提取，减压浓缩干燥后得到总浸膏，将总浸膏用水分散，得到的总悬浮液再用乙酸乙酯萃取，浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取部位。

2）硅胶柱层析分离：

乙酸乙酯萃取部位进行硅胶柱层析分离，石油醚-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，薄层色谱检测，收集Rf值在0.4-0.6的洗脱液，洗脱液浓缩干燥得雷公藤红素组分。

3）制备高效液相色谱纯化：

雷公藤红素组分用甲醇溶解，微孔滤膜过滤，反相高效制备色谱分离，以甲醇-水溶液为洗脱体系，紫外检测器监测，收集雷公藤红素的色谱峰，流份浓缩干燥后得到雷公藤红素粗产物。

4）凝胶纯化

雷公藤红素粗产物用甲醇溶解，经甲醇凝胶柱纯化之后，得到纯度大于98%雷公藤红素对照品。

所述步骤1）的具体过程为：雷公藤根部，粉碎后用体积分数为80%-100%的乙醇溶液常温下提取，提取1-3次，合并提取液，减压浓缩干燥后得到总浸膏。将总浸膏用水分散，分散时用的水的体积为总浸膏体积的4-5倍，萃取用的乙酸乙酯与总悬浮液的体积相当，萃取1-3次。合并萃取液，减压浓缩干燥后得到乙酸乙酯萃取部位。

所述步骤2）的具体过程为：硅胶柱层析采用的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂，其体积比例为4:1-1:1；薄层色谱采用的薄层板为GF254荧光板，展开剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶液，其体积比例为2:1-1:1，紫外灯254nm处检视暗斑点，收集Rf值在0.4-0.6的洗脱液，洗脱液浓缩干燥得雷公藤红素组分。

所述步骤3）的具体过程为：雷公藤红素组分用甲醇溶解，配置样品浓度为50-150mg/mL；制备色谱柱的填充填料为C18，制备柱长20-22cm、直径5-7.5cm；采用的流动相为体积分数为80%-90%的甲醇水溶液，用甲酸调节至pH=4；进样体积为5-10mL，流速控制在80-180mL/min。

所述步骤4）的具体过程为：凝胶的型号为Sephadex LH-20，根据颜色来收集流分，浓缩干燥得到雷公藤红素纯品。

为确证本发明所制备的对照品的结构，雷公藤红素测试了UV、MS、MS/MS、HR-MS、¹H NMR、¹³C NMR等。

本发明从雷公藤乙醇提取物中分离雷公藤红素化学对照品具有如下优点和进步：