[发明专利]犬瘟热病毒与犬副流感病毒双重RT-PCR检测及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种犬瘟热病毒与犬副流感病毒双重RT-PCR检测及其专用引物；属于生物技术领域。 

背景技术

 犬瘟热病毒(CDV)与犬副流感病毒(CPIV)的RT-PCR检测方法是目前快速检测这两种病原的常用方法，被广泛应用于实验室病原诊断，与病毒分离的方法相比较，RT-PCR方法诊断更快速简便，病毒分离相对来说时间太长，在临床上不利于快速诊断，所以目前病毒病的实验室诊断主要应用PCR/RT-PCR方法。目前有一些CDV的RT-PCR试剂盒已经商品化并投入临床应用,但是,单独检测CPIV和一次性检测CDV与CPIV的RT-PCR方法尚没有商品化试剂盒。 

 目前毛皮动物病多病毒混合感染相当严重。商品化的CDV、CPIV的RT-PCR试剂盒都是单项RT-PCR，1个试剂盒1次试验仅能检测一种病毒，对于混合感染了CDV、CPIV的同份毛皮动物病料要确诊病原就需要2种试剂盒并且要做2次RT-PCR实验，不仅费时费力，而且检测成本也较高，既不经济也不快捷。康泰在《动物医学进展》2013年、第9期、62-65页，公开了3对引物；能分别用于特异扩增犬瘟热病毒F基因、犬细小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段。通过优化反应条件，建立同时扩增CDV（740bp）、CPV（419bp）和CPIV（559bp）的多重PCR方法。但是这三对引物对CDV、CPV、CPIV3种病毒的最低核酸检测量为1ng／μL；其灵敏性差。 

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能单独或/和同时检测CDV和CPIV、且灵敏度高的专用引物；所述CDV为犬瘟热病毒，CPIV为犬副流感病毒。 

本发明提供的专用引物，包括引物对A和/或引物对B， 

所述引物对A包括引物1和引物2，

所述引物对B包括引物3和引物4，

所述引物1、引物2、引物3、引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。

上述专用引物，所述引物对A能检测检测CDV，所述引物对B能检测CPIV；引物对A和引物对B同时使用能单独或同时检测CDV和CPIV。 

上述专用引物，可以是引物对A；也可以是引物对B；还可以是，由引物对A和引物对B组成； 

所述引物对A由引物1和引物2组成，

所述引物对B由引物3和引物4组成；

所述引物1、引物2、引物3、引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。

所述引物对A和所述引物对B可独立包装。 

本发明的第二个目的是提供一种能单独或同时检测CDV和CPIV的RT-PCR试剂。 

本发明的RT-PCR试剂，包含上述专用引物。 

上述RT-PCR试剂，可以是，由上述专用引物、dNTP、DNA聚合酶、M-MLV、RNase Inhibitor和PCR缓冲液组成。 

所述dNTP为脱氧核糖核苷三磷酸，M-MLV为一种鼠白血病逆转录酶，RNase Inhibitor为RNA酶抑制剂。 

上述RT-PCR试剂中， 

所述专用引物中各引物的终浓度均为0.4μM；

所述dNTP的终浓度均为0.4mM；

所述DNA聚合酶的终浓度均0.05 U/μL;

所述M-MLV的终浓度为2U/μL；

所述RNase Inhibitor的终浓度为3.2U/μL。

所述终浓度是指在25μL RT-PCR反应体系中的最终浓度。 

所述dNTP、DNA聚合酶和PCR缓冲液购自天根生化科技有限公司，产品目录号为ET101。 

所述M-MLV、RNase Inhibitor购自宝生物工程有限公司，产品目录号为2641A、2313A。 

上述RT-PCR试剂，能单独或同时检测CDV和CPIV。 

本发明的第三个目的是提供一种能单独或同时检测CDV和CPIV的RT-PCR试剂盒。 

一种RT-PCR试剂盒，含有上述RT-PCR试剂。 

上述RT-PCR试剂盒能单独或同时检测CDV和CPIV。 

所述专用引物、RT-PCR试剂或RT-PCR试剂盒在检测病毒或制备检测病毒产品中的应用；所述病毒具体为如下2种病毒中的至少一种：犬瘟热病毒和犬副流感病毒。 

本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本病毒的方法。 

一种检测或辅助检测待测样本病毒的方法，包括如下步骤：