[发明专利]一种具有肿瘤靶向性的非病毒阳离子基因载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有肿瘤靶向性的非病毒阳离子基因载体及其制备方法。

背景技术

合成高分子材料在基因治疗中是一个非常有前景的领域，利用这些合成高分子作为靶向载体，应用于癌症治疗正得到迅猛的发展。以特定的基因作为靶位的治疗策略成了国际制药领域的一大研究和开发的热点。基因治疗在实际应用过程中，存在的最大障碍是缺少安全、高效的载体系统。目前所采用的载体主要分为两大类，即病毒载体和非病毒载体。非病毒载体是将外源基因用各种人工的或天然的材料包装起来形成的传递系统，主要包括阳离子聚合物和磷脂。非病毒载体具有安全性好、重复性高、制备简单等多项优点。病毒载体是将外源基因包装到天然病毒的外壳中，利用病毒对宿主细胞的感染性将外源基因导入细胞中。病毒载体因具有转导效率及表达效率高的特点而得到广泛应用，但其本身存在不可避免的安全性问题，如表达外源基因时间短、免疫原性强、易引发强烈的炎症反应和免疫反应、毒性较大等。因此，开发全新的非病毒载体至关重要。

根据基因药物的理化性质，通常将载体系统设计成表面带有正电荷的微粒给药体系，通过静电的作用与带负电的核酸形成复合物，复合物经内吞等方式进入细胞，然后释放出基因药物，转运至细胞核并在核内得以表达。这种极简单的静电吸附原理，已经贯穿于整个非病毒类载体20多年的研究中。PEI（聚醚酰亚胺）是目前常用的阳离子转染聚合物，但是由于其毒性较高，转染效率低等缺陷限制了其使用，对PEI进行改性研究，同时加上靶向基团，增加其转染效率，并减少毒性，使其成为有效的非病毒传递系统，具有重大意义。

发明内容

本发明提供了一种新型的具有肿瘤靶向性的非病毒阳离子基因载体（FA-PEI-OA，在该载体中，PEI与油酰氯摩尔比为1:1～4:1，PEI-OA与叶酸的摩尔比为1:1～20:1）及其制备方法，该载体是由交联的阳离子聚合物聚醚酰亚胺-油酰氯（PEI-OA）形成疏水性核心结构，由具有肿瘤靶向性的配体叶酸（FA）作为外壳，赋予该传递系统穿透细胞膜的功能，形成性质稳定、生物兼容性好的靶向非病毒基因传递系统。制备的FA-PEI-OA载体系统具有肿瘤靶向性、毒性小、转染效率高等特点，可作为核酸药物的有效传递系统。

本发明同时提供了载体系统（FA-PEI-OA）与核酸（DNA/RNA）形成纳米复合物的制备方法，该纳米复合物用来评价专利中载体的传递效果。

本发明涉及到一种含有PEI、油酰氯（OA）和靶向配体叶酸（FA）的基因载体，该载体制备方法如下：

（1）PEI-OA的合成：将PEI溶于二氯甲烷中（浓度范围为0.5～5mg·mL^-1），将油酰氯溶解于三乙胺和二氯甲烷（三乙胺和二氯甲烷的体积比为2:1～8:1）的混合溶液中（油酰氯的浓度范围为0.2～2mg·mL^-1），按照PEI与油酰氯摩尔比为1:1～4:1比例，将油酰氯溶液缓慢地加入到PEI溶液中，并室温搅拌，控制搅拌转速为100～500rpm，反应进行6～24h，通过透析除去过量的三乙胺，最后通过真空干燥得到PEI-OA粉末；

（2）将步骤（1）得到的PEI-OA粉末使用溶剂溶解后，在DEPC水（焦碳酸二乙酯处理且经高温灭菌）、PB缓冲液或PBS缓冲液体系中与pH=6～8的叶酸溶液均匀混合（PEI-OA与叶酸的摩尔比为1:1～20:1），通过静电吸附作用制得FA-PEI-OA基因载体系统。

优选地，PEI的分子量为800～2000Da。

优选地，步骤（2）中的溶剂为无水乙醇或氯仿。

优选地，透析截留分子量为10～30K，透析时间为8～24h。

本发明同时涉及一种基因载体系统与核酸（DNA/RNA）复合物的制备，该复合物的制备方法为：将FA-PEI-OA基因载体系统与用DEPC水（焦碳酸二乙酯处理且经高温灭菌）溶解的DNA/RNA在PBS缓冲液体系中（FA-PEI-OA中PEI-OA与DNA/RNA的摩尔比为1:1～10:1）旋涡混合，室温孵育（10～30℃），即得FA-PEI-OA基因载体系统与核酸（DNA/RNA）复合物。

优选地，旋涡混合时间为10～30s。

优选地，孵育时间为20～60min。

本发明涉及的FA-PEI-OA基因载体系统具有较高的转染效率，具有一定的靶向性，在几株肿瘤细胞中均表现了低毒高效的特点。

附图说明

图1：实施例1制备的PEI-OA的¹H NMR谱图；