[发明专利]一种野牛草愈伤组织的诱导方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种野牛草愈伤组织的诱导方法。

背景技术

野牛草（学名：Buchloe dactyloides）是一种具有发达匍匐茎的暖季型草坪草。野牛草具有极强的耐旱、耐热和耐水淹性，抗病和再生能力强，适应范围广的特点，是目前应用较多的一种暖季型草坪草。但野牛草也存在一些缺点，如种子建坪的速度较慢，形成的草坪质量较差，色泽灰绿，在北方的绿期短、耐荫性和耐践踏性差、近距离观赏性和景观效果较差，冬相枯黄等等,这些缺点都限制了野牛草在我国的应用。为解决野牛草应用方面的难题，草坪科学工作者加强了野牛草的应用与基础研究，所涉及的研究领域也越来越广。但直至目前仍未培育中绿期明显延长的野牛草新品种，这也说明传统育种方法对这一性状改良存在一定的局限性。

现代生物技术的发展特别是转基因技术的发展使得我们对生物品种的选育和改良工作有了一个更为得心应手的工具。利用现代生物技术进行品种改良不但更经济、有效，且可大大缩短育种时间。水稻、玉米、小麦等禾本科植物已成功通过突变体筛选及转基因技术获得优良新品种，这诸多成功的案例为野牛草新品种的培育提供了重要的技术支撑。而大多数转基因技术能够顺利进行的基础和所必需的阶段是要建立高效的植株再生体系。目前以成熟胚为外植体的愈伤组织诱导在多种植物的再生体系建立方面上都有了广泛的应用，而以野牛草成熟胚为外植体的再生体系建立尚处于起步阶段。

在用于野牛草再生体系建立的各种外植体中，以成熟胚种子为外植体具有比其他外植体易采集、乃储藏、不受季节限制等优点，能保证不同个体间生理状态一致性和提供大量愈伤组织等优点，是开展遗传转化最为方便实用的受体，且成熟胚细胞具有潜在旺盛的分裂能力，是用于组织培养的良好材料。

2005年，钱永强以野牛草成熟胚为外植体材料，对外植体的灭菌、愈伤组织的诱导、继代及植株再生等各个培养阶段的影响因素进行了探讨；并从不同角度对愈伤组织的褐化诱因进行了研究。其是通过体胚发生途径建立野牛草再生体系的方法，将消过毒的种子培养3天后，无菌操作取出萌芽的成熟胚，垂直于胚轴切割数段后继续置于原培养基中培养，在培养20天后，愈伤组织诱导率达到86.67%。但此方法在操作过程中易发生外植体污染或死亡的现象，由于野牛草的种子较小，对其成熟胚进行切割很容易使得成熟胚失去活性，从而无法诱导出愈伤组织（钱永强,孙振元,李云,等.野牛草成熟胚植株再生及其影响因素研究[J].草业科学,2005(2):101-106.）。

李瑞芬以野牛草幼穗为外植体，建立了愈伤组织诱导、继代培养和植株再生体系。但这些工作都是处于起步阶段，还没有形成比较系统的研究结果，而且还都存在诱导出的愈伤组织褐化严重及再生率低的问题（李瑞芬,孙振元,魏建华,等.野牛草幼穗愈伤组织的诱导及植株再生[J].武汉植物学研究,2004(5):449-454.）。

现有的野牛草成熟胚愈伤组织诱导过程中存在着诱导率低，易污染的现象，通过本发明的方法可以避免愈伤组织因成熟胚材料消毒不彻底而引起的污染，使污染率降低到零，同时本发明的方法也提高了以野牛草成熟胚为外植体的愈伤诱导率，使得愈伤诱导率达到了90%以上。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种野牛草愈伤组织的诱导方法。该方法可以避免因外植体消毒不彻底而造成的污染；操作简便，能够获得大量的愈伤组织，愈伤诱导率在90%以上。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种一种野牛草愈伤组织的诱导方法，其特征在于，其以野牛草种子为外植体，消毒后进行萌发，挑选已萌发长出胚根的种子，转入愈伤组织诱导培养基，在25±1℃条件下黑暗培养20-25天；所述的愈伤组织诱导培养基为MS培养基+2，4-D3.0-3.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值5.8-6.0的固体培养基。

更为具体地，所述方法包括如下步骤：

1）种子的预处理：将种子从颖苞中取出；

2）外植体的消毒：将步骤1）中得到的种子用自来水洗净后，置于无菌操作台中用70%的酒精和有效氯浓度为7%-10%的次氯酸钠溶液进行消毒，再用无菌水清洗4-5遍；

3）种子的萌发：将步骤2）消毒过的种子置于铺有湿润无菌滤纸的培养皿中，置于25℃的光照培养箱中，暗培养1～2天，期间要保证无菌培养皿中有足够的无菌水以便种子萌发；