[发明专利]小核糖核酸病毒科重组载体和病毒样颗粒及制备方法和用途

权利要求书

1.一种小核糖核酸病毒科重组载体，其特征在于，将P1/P1op基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的两个启动下，所述的P1基因和3C基因均为小核糖核酸病毒科的P1基因和3C基因，所述的P1op基因为小核糖核酸病毒科的P1基因的优化基因。

2.根据权利要求1所述的小核糖核酸病毒科重组载体，其特征在于，将P1/P1op基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的P_polh启动子和P₁₀启动子下。

3.根据权利要求1所述的小核糖核酸病毒科重组载体，其特征在于，将P1/P1op基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的P_polh启动子和P_cmv启动子下。

4.一种小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒，其特征在于，包括权利要求1至3任一所述的小核糖核酸病毒科重组载体。

5.根据权利要求4所述的小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒，其特征在于，将P1/P1op基因和3C基因分别分别插入同一杆状病毒载体质粒的P_polh启动子和P₁₀/P_cmv启动子下，获得重组穿梭载体，转染至宿主细胞，获得重组杆状病毒，感染宿主细胞，获得病毒样颗粒。

6.根据权利要求4所述的小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒，其特征在于，所述的宿主细胞为昆虫细胞Sf9细胞株。

7.制备权利要求4所述的病毒样颗粒的方法：其特征在于，依次包括下述步骤：

1）引物设计

对pFast-dual质粒的P_polh启动子和P₁₀启动子分析，设计3C和P1/P1op基因引物；

2）穿梭载体构建

以pFast-dual为载体，采用PCR扩增3C和P1/P1op基因，回收片段，采用限制性内切酶对片段和pFastBac-dual载体进行酶切后，利用回收片段进行T4连接酶连接，并转化DH10a感受态，得到阳性菌落后，提取质粒得到重组的各个穿梭载体；

3）重组杆状病毒载体构建

将上述构建好的穿梭载体转化大肠杆菌DH10bac，选白色阳性菌落，进行PCR鉴定，得到阳性克隆，经过扩大培养阳性克隆后，提取重组杆粒；

4）重组杆状病毒的包装

将包含构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因的重组杆粒转染昆虫细胞Sf9后，得到包含构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因重组杆状病毒；

5）重组病毒样颗粒表达

培养权利上述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，在昆虫细胞中表达构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因，得到构建病毒样颗粒所需的蛋白，所述的构建病毒样颗粒所需蛋白进行自行组装，得到病毒样颗粒，形成的病毒样颗粒分泌到细胞培养上清中；

6）重组病毒样纯化

步骤5）中的上清经过初步离心去除大的细胞碎片后，采用切向流浓缩包进行浓缩后，经过分子筛和离子交换两步得到纯化的VLP免疫样品。

8.权利要求4所述的小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒作为人或者动物抗小核糖核酸病毒疫苗的药物用途。