[发明专利]小核糖核酸病毒科重组载体和病毒样颗粒及制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明公开了一种病毒重组载体，还公开了包括该病毒重组载体的病毒样颗粒及病毒样颗粒及制备方法和用途，具体地说，是同一质粒下的不同启动子高效表达小核糖核酸病毒科病毒的病毒重组载体和病毒样颗粒。

背景技术

小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）家族包含了17个属，大部分具有较强的致病性。其中肠病毒属(Enterovirus)，代表种：小儿麻痹症病毒(poliovirus脊髓灰质炎病毒)，手足口病毒71型（Enterovirus71，EV71）；鼻病毒属(Rhinovirus)，代表种：人类鼻病毒A(Human rhinovirus A)；肝病毒属(Hepatovirus)，代表种：肝炎A型病毒(Hepatitis A virus,HAV)；副肠内细胞病变人类孤儿病毒属(Parechovirus副肠孤病毒属)，代表种：人类副肠内细胞病变人类孤儿病毒(Human parechovirus人副肠孤病毒)，能够造成严重的人类疾病。另外心病毒属(Cardiovirus)，代表种：脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus)；鹅口疮病毒属(Aphthovirus)，代表种：口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)等能够引起猪牛等脊柱动物疾病。该科病毒对人类健康和生命财产造成极大的伤害，因此急需有效地防治手段。目前大部分病毒还没有疫苗和特效的治疗药物，或者疫苗需要提高其安全性和有效性。

该科病毒基因组非常相似，为单股正链RNA，长约7.2～8.4kb，两端为保守的非编码区，在肠道病毒中同源性非常高，中间为连续开放读码框架。此外，5’端共价结合约23氨基酸的蛋白质Vpg（genome-linked protein），3’端带有约50个核苷酸的poly A尾。读码框架区分为3个区域：P1、P2和P3。P2和P3区域编码7个非结构蛋白。其中3CD/3C为蛋白酶，负责其他蛋白的剪切功能；其他蛋白包括依赖RNA的RNA聚合酶3D，具有NTP酶活性和复合体定位细胞膜的2C，两种蛋白酶（2B、3AB），以及RNA5‘端共价多肽3B（VPg）等。P1区编码4个病毒结构蛋白VP1～VP4。VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣壳的表面，中和抗原和型特异性抗原位点主要集中在VP1蛋白，同时也是分型的主要依据；VP4位于衣壳内部，与病毒基因组脱壳有关。VP1、VP2和VP3蛋白形成的五聚体的顶端在病毒表面形成的峡谷样结构是受体分子结合的位点。

该类病毒粒子的装配分为4个步骤：（1）以肠道病毒为例，当外壳蛋白P1形成后，通过个3CD/3C蛋白进一步切割成三个紧密聚合的蛋白质（VP0、VP3、VP1）组成未成熟的原聚体（5S）。初期由于P1和蛋白酶浓度较低，该裂解速度较慢；（2）随着蛋白酶浓度增加，未成熟的原聚体浓度增加，从而形成五聚体（14S）；（3）然后12个五聚体形成空壳的（80S）病毒样颗粒（virus like particle，VLP）；（4）接着正股VPg-RNA进入病毒样颗粒形成病毒前体（150S），进而引发VP0裂解形成VP4和VP2，形成具有感染性的成熟病毒粒子。80S的病毒样颗粒不包含病毒的基因组，只是一个五聚体的仓库，不具有自主复制的能力和传染性。同时具有大部分的病毒颗粒的结构特征，因此是目前发展该类病毒疫苗的首选目标。

研究表明在该类病毒中，单独的3C蛋白能够切割P1蛋白，可以不需要3D蛋白的参与。其中FMDV的3C蛋白不但能够单独切割自身P1蛋白，并且能够切割polio等病毒，并且其切割效率较高。而polio病毒的3C蛋白不能完全切割P1蛋白，需要3D蛋白的参与。而EV71病毒3C蛋白切割效率的研究仍属空白。

目前研究已经有多种方法表达该类病毒VLP蛋白，用于疫苗研究。其中分别利用不同载体表达VP1、VP0和VP3的方法，转染后不能很好的得到病毒样颗粒。另外利用不同的启动子分别表达3CD和P1基因，利用表达后的3CD蛋白剪切P1基因后形成单体蛋白，然后形成VLP。目前报道一般利用3CD进行切割，但是3CD蛋白基因组较大（1600bp）加重了载体负载，同时影响了切割效率。目前利用杆状病毒系统和酵母系统的不同启动子分别表达3CD和P1，能够得到EV71、FMDV等病毒的病毒样颗粒。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种同一质粒的不同启动子下多个基因的表达和准确切割表达，并成功包装出的病毒样颗粒。