[发明专利]对氧磷酶1基因的表达纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白工程技术领域，具体涉及对氧磷酶1基因的表达纯化方法。

背景技术

对氧磷酶1(paraoxonase1,PON1)在研究有机磷中毒预防和治疗方面具有重要作用，但目前天然PON1很难获得，利用大肠杆菌表达的PON1虽然廉价且生产周期短，但获得的蛋白因缺少糖基化及磷酸化修饰，在体内应用时存在免疫排斥，半衰期短，易降解等问题。

目前虽然也有通过基因工程方法表达出具有活性的PON1基因的报道，但未能得到纯化的重组蛋白，也就没有比较完善的对氧磷酶1的表达纯化方法。

发明内容

为了解决现有技术中表达、纯化具有活性的PON1基因困难的问题，本发明提供了一种对氧磷酶1基因的表达纯化方法。

本发明的对氧磷酶1基因的表达纯化方法，步骤如下：

（1）扩增对氧磷酶1基因，连接到转移载体pFastBac^TM1上构建重组转移载体，重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，获得含有对氧磷酶1基因的重组杆状病毒DNA，将重组杆状病毒DNA转染家蚕BmN细胞使其在细胞内复制装配成含对氧磷酶1基因的重组病毒；

（2）步骤（1）的重组病毒接种家蚕五龄幼虫，发病后取蚕血，经离心过滤除杂并经浓缩后用汽巴蓝亲和层析以及抗体亲和层析纯化蚕血，获得对氧磷酶1蛋白。

优选地，上述对氧磷酶1基因的表达纯化方法中，步骤（1）所述扩增使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~2所示。

优选地，上述对氧磷酶1基因的表达纯化方中，步骤（2）所述离心为4℃条件下以10000 rpm的转速离心30 min；所述过滤除杂是采用9层医用纱布过滤后再经过0.45μm滤膜；所述浓缩是用10 kD超滤管进行。

优选地，上述对氧磷酶1基因的表达纯化方法中，步骤（2）所述汽巴蓝亲和层析使用的固定相为汽巴蓝琼脂糖-3GA3000-CL。

优选地，上述对氧磷酶1基因的表达纯化方法中，步骤（2）所述抗体亲和层析所用抗体是通过原核表达的对氧磷酶1基因四次免疫新西兰雄兔后取血然后通过ProteinA纯化制得。

本发明的有益效果：通过设计引物，构建重组病毒vBm-PON1，将其接种家蚕五龄幼虫，使其表达目的蛋白PON1，通过汽巴蓝亲和层析和抗体亲和层析纯化得到了纯度较高的PON1。此方法解决了天然PON1含量低，纯化难得问题，为以后研究PON1功能奠定基础。

附图说明

图1为重组转移载体pFastBac^TM1-PON1的双酶切-PCR鉴定图M：DNA ladder marker；1：双酶切产物；2：PCR产物。

图2为重组Bacmid-PON1的PCR鉴定图；M.DNA ladder marker，1.PON1 F/PON1R PCR产物，2. PON1 F/M13R PCR 产物，3. M13F/PON1R PCR 产物，4. M13F/M13R PCR产物。

图3为重组杆状病毒BmNPV-PON1在家蚕五龄幼虫中表达产物的SDS-PAGE图，M.蛋白质低分子质量标记，1. 接种野生病毒的蚕血，2. 接种重组病毒的蚕血。

图4为重组杆状病毒BmNPV-PON1在家蚕五龄幼虫中表达产物的Western blotting鉴定图，M. 蛋白质低分子质量标记，1’. 接种野生病毒的蚕血，2’. 接种重组病毒的蚕血。

图5为纯化蚕血的SDS-PAGE鉴定图，M.：蛋白质低分子质量标记，1：接种野生病毒的蚕血，2：接种重组病毒的蚕血原样，3：汽巴蓝亲和层析柱初步纯化的蚕血，4：抗体亲和层析柱进一步纯化的蚕血。

图6为纯化蚕血的Western blotting鉴定图，M.：蛋白质低分子质量标记，1’：接种野生病毒的蚕血，2’：接种重组病毒的蚕血原样，3’：汽巴蓝亲和层析柱初步纯化的蚕血，4’：抗体亲和层析柱进一步纯化的蚕血。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

生物材料及试剂来源：