[发明专利]一种原始生殖细胞的爬片方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种原始生殖细胞的爬片方法。

背景技术

原始生殖细胞（Primordial germ cells, PGCs）是形成生殖细胞的前体细胞，在性成熟的个体中生能够特异性的生成精子和卵子（Durcova-Hills G等, PloS one,  2008.3: e3531）。家禽作为卵生动物，单个胚胎较难获得，因此PGCs细胞的研究尤为重要，随着PGCs细胞体外培养体系的建立，以PGCs细胞为基础的现代保种技术研究以及转基因技术研究得以迅速发展。

PGCs细胞是一种理想的制备转基因动物的原料。2006年，Marie-Cecile van de Lavoir等人成功建立了鸡PGCs细胞在体外的长期培养技术，体外培养至200天左右的PGCs细胞仍具有生殖干细胞的特性，通过体外转染绿色荧光蛋白，经筛选后注入孵化至13-15期的受体鸡胚中，获得可进行生殖细胞系遗传的转基因鸡（van de Lavoir MC等, Nature, 2006. 441:766-9 ）。2012年，Tae Sub Park等人通过 piggyBac转座子转染PGCs细胞获得了可表达绿色荧光的转基因鸡，并对外源基因在染色体上的位置进行了定位（Park TS等, PNAS, 2012. 109: 9337-41）。同年，Joni Macdonalda等人也通过piggyBac 和 Tol2转座子转染PGCs细胞获得了转基因鸡（Macdonald, J.等, PNAS, 2012. 109: e1466-72.）。中国农业大学李赞东教授根据PGCs细胞的发育特性，选择在鸡胚发育至13-15期时，血管注射慢病毒载体，成功获得了可遗传的转基因鹌鹑，与传统的胚盘下腔注射法相比，G1后代的转基因效率可提高7倍（Zhang Z等, PloS one, 2012. 7: e50817）。

PGCs细胞可用于的现代保种研究。早在1989年，Wentworth BC等就证实了鹌鹑的PGCs细胞可用于制备生殖细胞系遗传的嵌合体鹌鹑（Wentworth BC等, Poultry science, 1989. 68: 999-1010）。2005年，Yonghong Song等人将孵化至27期的鸡胚性腺中分离的PGCs细胞注入Busulfan处理的发育至15-17期的受体鸡胚血管中，提高了供体鸡的生殖细胞嵌合率（Song Y等, Mol Reprod Dev,  2005. 70: 438-44.）。2008-2010年间， Yoshiaki Nakamura等人通过Busulfan处理方法的改进，获得了只产生供体鸡的生殖细胞嵌合体鸡（Nakamura Y等, Reprod Fertil Dev, 2008. 20:900-7；Nakamura Y等, Biol Reprod, 2010. 83: 130-7）。为了简化操作程序，2012年，Yoshiaki Nakamura等人又通过优化X射线照射的方法，提高了供体鸡胚的生殖细胞嵌合率（Nakamura Y等, J Reprod Develop, 2012. 58: 432-7）。同年，Marie-Cecile van de Lavoir等人对1只雄性鸡胚的PGCs细胞进行体外培养，使约200个的PGCs细胞扩增数百万倍，经含有绿色荧光蛋白基因的载体转染后，筛选稳定表达细胞株，并注入珍珠鸡的血管中，获得了生殖细胞系遗传的嵌合体珍珠鸡，通过采集珍珠鸡精液与供体母鸡的杂交，获得供体鸡，实现了PGCs细胞在异种动物间的遗传（van de Lavoir MC等, PloS one, 2012. 7: e35664）。

PGCs细胞可用于以PGCs细胞为基础的基因表达调控研究、现代育种保种研究以及转基因研究，具有一定的科研价值。

现有的原始生殖细胞的爬片方法为：将载玻片放于培养皿中，加入饲养层细胞，待饲养层细胞在载玻片上生长成单层后，使用丝裂霉素或γ-射线处理终止其分裂后，加入PGCs细胞，经过约24小时的培养，PGCs细胞吸附于饲养层细胞上，完成细胞爬片，取出载玻片，PBS洗涤后，使用4%的多聚甲醛或其它固定液进行固定并进行后续的实验，整个过程需2天以上的时间，耗时费力。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种原始生殖细胞的爬片方法的技术方案。

所述的一种原始生殖细胞的爬片方法，其特征在于包括以下步骤：

1）对原始生殖细胞进行纯化；

2）对纯化后的原始生殖细胞采用PBS洗涤3次，离心收集细胞；