[发明专利]一种基于微流控芯片和核酸适配体识别技术的腺苷检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微全分析系统的生物学检测技术领域，涉及一种基于微流控芯片和核酸适配体识别技术的腺苷检测方法。

背景技术

腺苷是一种内源性核苷，因其在中枢神经和周围神经系统信号表达中的重要作用，受到广泛关注及研究。同时腺苷作为腺苷脱氨酶的作用底物，其含量变化也会间接反应腺苷脱氨酶的体内代谢水平，而腺苷脱氨酶活性的检测对于临床许多疾病的诊断都具有重要参考价值，因此发展腺苷的新型检测方法对于医学临床诊断及机体代谢水平具有重要意义。传统腺苷检测方法主要为HPLC、紫外检测、流式检测法及荧光分析法等技术，这类技术检测灵敏度有限，而且需要较大体积的检测溶液，使得在高灵敏微量分析领域的应用受到局限。微流控微珠阵列芯片是微流控芯片研究领域中发展的一种新型芯片模式，该技术的发展较好解决了微量样品条件下高通量、高灵敏检测的难题，同时检测过程简单，不需要昂贵的检测仪器，为发展未来自动化高性能生物分子检测平台技术提供了新的方向。

核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)从随机单链寡聚核苷酸文库中筛选的能特异结合蛋白或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸，长度一般为25-60个核苷酸。与抗体相比，核酸适配体具有易合成、易修饰、易固定、可反复使用、可长期保存及没有或极小的免疫原性等特点，而且与目标分子结合表现出高效、专一的特性，因而核酸适配体生物传感器在蛋白质研究、药物检测、医学诊断等方面得到广泛应用。酶功能化纳米颗粒作为一种检测标记材料，由于一个纳米颗粒上能携带多个酶分子，已经成为信号放大技术领域中的一种极具应用前景的信号放大方法。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种基于微流控芯片和核酸适配体识别技术的腺苷检测方法，将微流控芯片、核酸适配体识别、多酶纳米信号放大技术有机结合起来，发展了一种用于腺苷检测的高性能生物传感技术，将具有广阔的应用前景。其技术方案如下：

一种基于微流控芯片和核酸适配体识别技术的腺苷检测方法，包括以下步骤：

(1)生物素修饰的腺苷核酸适配体和生物素修饰的酪蛋白通过生物素-亲合素结合方法固定于亲合素修饰微球的表面形成功能化微球，所述微球固定在微流控芯片检测区的相应微型小室中，形成微流控微珠阵列检测芯片；

(2)将辣根过氧化物酶和巯基修饰的捕获探针修饰到纳米颗粒上作为信号标记；

(3)将步骤(2)形成的功能化纳米颗粒流入微流控微珠阵列检测芯片的检测区与微珠阵列杂交，洗脱后流入腺苷溶液与杂交微球孵育，由于腺苷核酸适配体能与腺苷结合形成特定的空间构型，会导致功能化纳米颗粒从微球表面脱离；

(4)流入过氧化物酶底物溶液，通过多酶纳米信号放大技术将生物素化的酪胺结合到微球表面的酪蛋白上，洗脱后流入亲合素标记的量子点，所述量子点能与微球表面酪蛋白上结合的生物素识别并固定；

(5)通过计算流入腺苷后微球表面荧光与未流入腺苷微球表面荧光的比值对腺苷进行定性和定量。

进一步优选，步骤(1)中所述的功能化微球表面修饰的生物素修饰的腺苷核酸适配体和生物素修饰的酪蛋白，其摩尔浓度比值为1∶100～1∶120。

进一步优选，步骤(1)中所述的微球是二氧化硅微球、聚苯乙烯类有机聚合物微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的任意一种。

进一步优选，步骤(2)中所述的纳米颗粒为金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和聚苯乙烯纳米颗粒中的任意一种。

进一步优选，步骤(3)中所述的腺苷溶液与杂交微球孵育，孵育时间为20～25min。

进一步优选，步骤(4)中所述的过氧化物酶底物溶液包含0.007％～0.009％H₂O₂、250～350μM生物素化的酪胺、50～100mM的NaCl。

进一步优选，步骤(4)中所述的量子点为CdSe、CdTe、CdS和复合型量子点中的一种，其发射范围为400nm～700nm。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明微流控芯片具有微量检测和高通灵敏检测的双重特性，能够较好的解决常规分析方法中微量检测、高灵敏检测以及高通量分析等性能难以兼容的问题，可实现微量样品的高灵敏分析；本发明采用多酶纳米信号放大及量子点荧光技术，可高灵敏检测分析目标，能够检测0.1pM的腺苷，而且实现了血清样品中腺苷的特异及准确的定量分析；本发明的建立为腺苷的微量及高灵敏检测提供了一种有力的检测手段。