[发明专利]一种从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法

权利要求书

1.一种从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法，具体步骤如下：

1）将微囊藻粉与无水甲醇以1g：10-40ml的比例进行混合，先置于超声清洗仪中100%超声处理5-10min，然后置于40-50℃的水浴锅中处理2.5-4小时，期间上下混匀数次，9000-11000rpm/min条件下离心，离心15-20min，取上清；滤渣以上述微囊藻粉与无水甲醇的比例重新加入无水甲醇抽提，重复抽提2~3次，将收集的上清合并； 

2）将收集的上清液置于氮吹仪中，氮气吹干，以蒸馏水与藻粉重量比为1:1~5:1加入蒸馏水复溶；

3）在复溶后溶液中加入等体积的氯仿，充分混匀；

4）以9000-11000rpm/min的条件下离心15-20min，收集上清液；

5）上清液过0.22μm针式过滤器，收集滤液；

6）滤液再经过strata-x固相萃取小柱处理，收集的滤液在-50~-60℃下冷冻干燥后称重。

2.根据权利要求1所述的方法，固相萃取的具体步骤为：

活化：先使用10-40ml的无水甲醇，然后使用10-40ml超纯水活化小柱，流速为 2-5ml/min；

上样：上样前样品溶液中加入0.2m/L的NaOH溶液，使样品pH值到6.5-8.0；

淋洗：先使用无水甲醇20-60ml，再使用超纯水活化20-60ml；流速为2-5ml/min；

洗脱：洗脱溶液使用0.1%体积比的HCl甲醇10-20ml，流速2-5ml/min，收集的滤液在-50~-60℃下冷冻干燥后称重，所述HCL浓度为1m/l。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在洗脱溶液总体积不变的情况下，洗脱两次。

4.根据权利要求1或2所述的方法，微囊藻的培养方法如下：

A. 培养液的配制：常规蓝藻培养基；

B. 微囊藻的培养： 

（1）一级培养：由试管原种接种到250ml的培养瓶中，通气培养，调节气流到1-2L/min，气流经过针头式过滤器无菌处理连接，光强控制在40-60μEm^-2s^-1，温度控制在25-28℃，当培养5-8天后，转入二级培养；

（2）二级培养：将一级培养所得的培养物接入到2L培养瓶中，通气培养，调整气流到3-4L/min，气流经过针头式过滤器无菌处理连接，光强控制在60-80μEm^-2s^-1，温度控制在25-28℃，当培养5-10天后，转入三级培养；

（3）三级培养：将二级培养所得的培养物转移到10L的培养瓶中，通气培养，调整气流到4-6L/min，气流经过针头式过滤器无菌处理连接，光强控制在80-100μEm^-2s^-1，温度控制在25-28℃，培养8-10天。

5.权利要求1所述方法在制备的类菌胞素氨基酸Shinorine中的应用。