[发明专利]一种从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和资源利用与可持续发展领域，更具体涉及一种从微囊藻提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法。

背景技术

目前，对微囊藻的利用几乎是空白，更不用说从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸并加以利用了。

类菌胞素氨基酸（mycosporine and mycosporine-like）是一大类以环己烯酮为基本骨架,与不同类型氨基酸通过缩合作用形成的水溶性物质，能在真菌、海洋细菌、蓝藻和真核藻类细胞中合成，并在海生无脊椎动物和鱼类等生物体内积累，其分子大小一般小于400Da，这类物质在310-360nm范围内具有很强的光吸收能力。很多微囊藻都含有类菌胞素氨基酸，他们能帮助微囊藻抵抗紫外线的侵袭，为微囊藻的生长创造条件。类菌胞素氨基酸这类具有极强的抗紫外辐射的能力，可用于光保护行业，特别是化妆品行业。目前，我国使用的光保护物质主要是化学合成，长期使用化学合成物质对人体皮肤容易造成伤害，从而不利于人类健康。

而且，目前国内对类菌胞素氨基酸的提取涉及很少，并且纯度不高。特别是目前世界范围内都没有商品的类菌胞素氨基酸标准品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法，该方法简单，操作方便，安全可靠。

本发明的另一个目的在于提供了一种从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法在制备的类菌胞素氨基酸Shinorine中的应用。通过该方法，得到的最终产品的纯度达到85%-95%，可以作为标准品使用，或其他商品化用途，为后续大规模提取定量打下坚实基础。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法，具体步骤如下：

1.将微囊藻粉与无水甲醇以1g：10-40ml的比例进行混合，先置于超声清洗仪中100%超声处理5-10min，然后置于40-50℃的水浴锅中处理2.5-4小时，期间上下混匀数次，9000-11000rpm/min条件下离心，离心15-20min，取上清；滤渣以上述微囊藻粉与无水甲醇的比例重新加入无水甲醇抽提，重复抽提2～3次，将收集的上清合并；

2.将收集的上清液置于氮吹仪中，氮气吹干，以蒸馏水与藻粉重量比为1:1～5:1加入蒸馏水复溶；

3.在复溶后溶液中加入等体积的氯仿，充分混匀；

4.以9000-11000rpm/min的条件下离心15-20min，收集上清液；

5.上清液过0.22μm针式过滤器，收集滤液；

6.滤液再经过strata-x固相萃取小柱处理，收集的滤液在-50～-60℃下冷冻干燥后称重。

本发明所用试剂或材料市售的均可使用，步骤6中用固相萃取小柱处理滤液时，可依据常规方式处理，或选择以下处理方式，步骤如下：

a：活化，先使用10-40ml的无水甲醇，然后使用10-40ml超纯水活化小柱，流速为2-5ml/min；

b：上样：上样前样品溶液中加入0.2m/L的NaOH溶液，使样品pH值到6.5-8.0；

c：淋洗：先使用无水甲醇20-60ml，再使用超纯水活化20-60ml；流速为2-5ml/min；

d：洗脱：洗脱溶液使用0.1%（v:v）HCl甲醇10-20ml（所用HCL浓度为1m/l），流速2-5ml/min；

e：收集的滤液在-50～-60℃下冷冻干燥后称重。

优选的，在步骤d中的洗脱溶液总体积不变的情况下，进行两次相同条件洗脱。

优选的，上样时不施加压力，使溶液自然流下。

所述的微囊藻可通过常规方式进行培养，也可通过本发明所述方式进行，具体培养步骤如下：

1.培养液的配制：常规蓝藻培养基；

2.微囊藻的培养：

（1）一级培养：由试管原种接种到250ml的培养瓶中，通气培养，调节气流到1-2L/min，气流经过针头式过滤器（0.22μm）无菌处理连接，光强控制在40-60μEm^-2s^-1，温度控制在25-28℃，当培养5-8天后，转入二级培养；

（2）二级培养：将一级培养所得的培养物接入到2L培养瓶中，通气培养，调整气流到3-4L/min，气流经过针头式过滤器（0.22μm）无菌处理连接，光强控制在60-80μEm^-2s^-1，温度控制在25-28℃，当培养5-10天后，转入三级培养；