[发明专利]固定化的全人源ECM包被基质的制备方法

权利要求书

1.一种无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，该方法为：

1)从人脐带获得脐带间充质细胞；

2)用裂解液裂解脐带间充质细胞，获得全人源细胞外基质；

3)用甲醇固定细胞外基质，获得固定化的全人源细胞外基质。

2.根据权利要求1所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，所述的从人脐带获得脐带间充质细胞的方法为：

1)将从人足月胎儿得到的新鲜人脐带用PBS冲洗三次；

2)把脐带剪成小段，剥离两动脉和一静脉；

3)血管去除后，分离华通氏胶；

4)将分离出的华通氏胶剪成小块，加入适量培养基，放入37℃的CO₂培养箱中培养；

5)培养三天后，每隔4-5天换液一次，2-3周后可见组织块周围有细胞爬出；

6)当细胞80％汇合后，进行传代培养。

3.根据权利要求1所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，所述的固定化全人源细胞外基质的步骤为：

1)将P5-P15代人脐带间充质细胞传到培养板上；

2)待其生长4-5天达到100％汇合，以便积累足够的ECM；

3)开始裂解前，加入洗液1洗一次；

4)加入裂解液，室温放置5-10分钟；

5)裂解结束后，立即吸去裂解液，加入洗液2，洗4-5次；

6)最后一次洗涤结束后，加入60％～100％甲醇室温固定；

7)培养板真空干燥，4℃保存。

4.根据权利要求3所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，所述的裂解液为：0.3％脱氧胆酸钠+10mM Tris-HCl+10mM EDTA，pH=8.0，0.22μm滤膜过滤，室温保存。

5.根据权利要求3所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，所述的洗液1的组成为：10mM Tris-HCl+10mM EDTA，pH=8.0，灭菌后室温保存。

6.根据权利要求3所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，所述的洗液2的组成为：1mM EDTA，pH=8.0，灭菌后室温保存。

7.根据权利要求3所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，步骤6)中加入80％～90％的甲醇室温固定。