[发明专利]固定化的全人源ECM包被基质的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化的人脐带来源的细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)的制备方法。

背景技术

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)是具有自我更新能力的多能干细胞，它们从囊胚期的内细胞团分离得到，有分化为三胚层的能力，因此用于组织修复和药物筛选的前景广阔。适合hESC临床应用的培养体系必须具有无动物源性，成分确定，适合大规模生产等优点。而hESCs对生长条件苛刻。只有合适的培养基质与培养基相互配合，才能长期维持其未分化状态。在传统的培养体系中，人胚胎干细胞通常分为有饲养层和无饲养层培养。在有饲养层培养体系中，hESC通常是在CF-1小鼠饲养层上进行培养。为了降低培养体系中的动物成分，制备适合hESC临床应用的培养基质，一些人源细胞取代了小鼠的饲养层。尽管已经证实新生儿包皮成纤维细胞，成人皮肤成纤维细胞，人输卵管上皮细胞，人脐带来源细胞等可以支持hESC的生长，但是这种共培养体系的操作步骤繁琐。首先需要将饲养层细胞用丝裂霉素C或伽马射线处理，使其失去增殖能力。其次在hESCs每次传代前都需要预铺饲养层细胞，它们的状态和密度都直接影响着hESCs的生长。为了简化培养体系，很多人尝试用各种细胞外基质(ECM)代替饲养层细胞。目前基质胶(Matrigel)是无饲养层培养体系中最常用的包被材料，它是从小鼠EHS肉瘤提取的，含有层黏连蛋白，胶原IV，硫酸乙酰肝素，巢蛋白等多种成分。但是Matrigel来源于小鼠EHS肉瘤，含有鼠源成分，所以不适合hESCs的临床应用。为了减少培养体系中动物成分，使人胚胎干细胞更好地应用于临床，一些无异源成分的ECM包被基质被应用于人胚胎干细胞的培养，如玻连蛋白，多肽，人胎盘提取的ECM等。但是它们的生产工艺复杂，不适合大规模生产，且效果不及饲养层细胞和Matrigel。本发明涉及的无异源成分的培养基质来源于人脐带间充质细胞，制备方法简单，是一种全人源的，可以长期保存的，适合人胚胎干细胞长期培养生长的固定化细胞外基质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固定化的全人源细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)包被基质及其制备方法，以降低人胚胎干细胞培养体系中的异源成分，为最终临床级人胚胎干细胞的体外扩增探索出一个新的途径。

固定化的人源ECM包被基质的制备步骤是：1)从人脐带获得脐带间充质细胞；2)甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备。

其中，从人脐带获得脐带间充质细胞的方法为：

1)将从人足月胎儿得到的新鲜人脐带用PBS冲洗三次；

2)把脐带剪成小段，剥离两动脉和一静脉；

3)血管去除后，分离华通氏胶；

4)将分离出的华通氏胶剪成小块，加入适量培养基，放入37℃的CO₂培养箱中培养；

5)培养三天后隔4-5天换液一次，2-3周后可见组织块周围有细胞爬出；

6)当细胞80％汇合后，进行传代培养；

7)人脐带间充质细胞P1代后每2-3天传代一次。

其中，甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备方法为：

1)将P5-P15代的人脐带间充质细胞按正常传代密度传到培养板上；

2)待其生长4-5天达到100％汇合，以便积累足够的ECM；

3)开始裂解前，加入洗液1洗一次；

4)加入裂解液，室温放置5-10分钟；

5)裂解结束后，立即吸去裂解液，加入洗液2，洗4-5次；

6)最后一次洗涤结束后，加入60％～100％甲醇室温固定；

7)培养板真空干燥，4℃保存；

其中，上述甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备方法中，所用试剂的配方为：

1)洗液1：10mM Tris-HCl+10mM EDTA，pH＝8.0，高压灭菌后室温保存；

2)裂解液：0.3％脱氧胆酸钠+10mM Tris-HCl+10mM EDTA，pH=8.0，0.22μm滤膜过滤，室温保存；

3)洗液2：1mM EDTA，pH=8.0，高压灭菌后室温保存。

优选地，步骤6)中加入80％～90％甲醇室温固定，固定时间5-10min。

本发明披露的固定化的全人源ECM包被基质及其制备方法主要有以下有益效果：

1)解决了hESCs培养中操作繁琐的问题，制备了一种即用型的hESCs培养基质；