[发明专利]一种大黄鱼脑细胞系及其建立方法

权利要求书

1.一种大黄鱼脑细胞系，其特征在于：该细胞系于2013年10月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为：CCTCC NO:C2013156。 

2.一种权利要求1所述的大黄鱼脑细胞系的建立方法，其特征在于：包括如下步骤： 

（1）大黄鱼脑组织的获取：将7个月大，长9-11cm的大黄鱼鱼苗在含青霉素及链霉素双抗的灭菌海水中暂养1-1.5小时，然后滴入占灭菌海水体积0.005-0.015%的丁香酚，直至鱼体翻转，腹部朝上，对刺激物应激行为为止；以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液，以浸有酒精的棉球擦拭鱼体表面后，取出大黄鱼脑组织并置于含青霉素及链霉素双抗的D-hanks液中； 

（2）原代培养：将上述大黄鱼脑组织切碎至0.7-2.0mm³的小组织块，以D-hanks液漂洗，最后以完全培养液洗；漂洗后将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，吸除多余培养液，翻转瓶身27℃恒温干贴24小时，再加入完全培养液翻正瓶身以使小组织块浸入培养液中，于27℃恒温培养启动原代培养，每周更换完全培养液一次； 

（3）传代培养：原代培养至贴壁细胞增殖至至少50-60%覆盖率时，移除旧培养液,并清洗去除残留的血清和二价金属离子；然后以0.25%胰酶消化法传代悬起细胞，以1:2-10进行传代；以后每隔2-8天传代一次，所述大黄鱼脑细胞系建立成功。 

3.如权利要求2所述的一种大黄鱼脑细胞系的建立方法，其特征在于：所述完全培养液中包括：DMEM/F12培养液、胎牛血清FBS、β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人FGF-basic、人EGF、人HGF、青霉素及链霉素。 

4.如权利要求3所述的一种大黄鱼脑细胞系的建立方法，其特征在于：所述完全培养液为：以DMEM/F12培养液为基础，包括终浓度分别为16.7%胎牛血清FBS、0.5‰β-巯基乙醇、50μg/mL N-乙酰葡糖糖胺、50μg/mL羧甲基纤维素钠、10μg/L人FGF-basic、5μg/L人EGF、1μg/L人HGF、100IU/mL青霉素以及100μg/mL链霉素。