[发明专利]一种大黄鱼脑细胞系及其建立方法

说明书

技术领域

本发明属于鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种大黄鱼脑细胞系及其建立方法。

背景技术

大黄鱼（Larimichthys crocea），硬骨鱼纲，鲈形目，石首鱼科，黄鱼属。肉质鲜嫩，经济价值较高，市场需求量较大。上世纪70年代以前野生大黄鱼资源较充沛，年平均捕捞量一度达到12万吨的水平。70年代初由于对野生大黄鱼尤其是对其越冬群体的滥捕乱捞，致使野生大黄鱼产量迅速枯竭。80年代以后，随着近海经济开发、环境污染等原因，导致近海的原各大产卵场不再适宜大黄鱼产卵，现野生大黄鱼捕获量极低。1986年大黄鱼人工育苗得以突破，随后得到重视迅猛发展，现阶段市场大黄鱼都是由海水养殖大黄鱼来提供^[84]。然而，现阶段伴随工业化发展，近海养殖环境进一步恶化；大黄鱼病害频发；大黄鱼亲鱼资源枯竭，种质退化等因素极大的限制了大黄鱼养殖的进一步发展，现阶段大黄鱼养殖产量约8.6万吨，不及70年代以前的捕捞量。因此对大黄鱼病害防治、良种选育、遗传背景的研究极为迫切。

建立鱼类细胞系能为鱼类病毒分离、抗病毒机制、疫苗研发、转基因技术、嵌合体组织工程等研究提供极大的便捷，且设施人力等资源要求相对活体实验低，重复性好，研究周期短。目前关于大黄鱼细胞系的建立仅有孙爱在2010年报道建立了大黄鱼成鱼的鱼鳍、吻端、脾脏三种细胞系，而未见其他组织细胞系的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大黄鱼脑细胞系。

本发明的另一目的在于提供上述大黄鱼脑细胞系的建立方法。

本发明的技术方案如下：

一种大黄鱼脑细胞系，该细胞系于2013年11月保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为：CCTCC NO:C2013156。

本发明的另一技术方案如下：

一种上述大黄鱼脑细胞系的建立方法，包括如下步骤：

（1）大黄鱼脑组织的获取：将7个月大，长9-11cm的大黄鱼鱼苗在含青霉素及链霉素双抗的灭菌海水（青霉素及链霉素双抗购自康宁公司，该双抗的100X浓缩液含10000U/mL青霉素以及10000μg/mL链霉素，配制海水时每100mL海水加入1mL青霉素及链霉素双抗的100X浓缩液）中暂养1-1.5小时，然后滴入占灭菌海水体积0.005-0.015%的丁香酚，直至鱼体翻转，腹部朝上，对刺激物应激行为为止；以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液，以浸有酒精的棉球擦拭鱼体表面后，取出大黄鱼脑组织并置于含青霉素及链霉素双抗的D-hanks液（100mL D-hanks液加入1mL青霉素及链霉素双抗的100X浓缩液）中；

（2）原代培养：将上述大黄鱼脑组织切碎至0.7-2.0mm³的小组织块，以D-hanks液漂洗，最后以完全培养液漂洗；漂洗后将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，吸除多余培养液，翻转瓶身27℃恒温干贴24小时，再加入完全培养液，翻正瓶身以使小组织块浸入培养液中，于27℃恒温培养启动原代培养，每周更换完全培养液一次；

（3）传代培养：原代培养至贴壁细胞增殖至至少50-60%覆盖率时，移除旧培养液,并清洗去除残留的血清和二价金属离子；然后以0.25%胰酶消化法传代悬起细胞，以1:2-10进行传代；以后每隔2-8天传代一次，所述大黄鱼脑细胞系建立成功。

在本发明的一个优选实施方案中，所述完全培养液中包括：DMEM/F12培养液、胎牛血清FBS、β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人FGF-basic、人EGF、人HGF、青霉素及链霉素。

在本发明的一个优选实施方案中，所述完全培养液为：以DMEM/F12培养液为基础，包括终浓度分别为16.7%胎牛血清FBS、0.5‰β-巯基乙醇、50μg/mL N-乙酰葡糖糖胺、50μg/mL羧甲基纤维素钠、10μg/L人FGF-basic、5μg/L人EGF、1μg/L人HGF、100IU/mL青霉素以及100μg/mL链霉素。

本发明的有益效果是：

1、本发明的大黄鱼脑细胞系可连续传代，迄今已传代40代，能够提供大量的大黄鱼脑细胞系，用于病原特性研究、疫苗研制、功能基因研究及育种研究等。

2、本发明的大黄鱼脑细胞系的构建方法重复性强、构建的细胞系稳定性好；

3、本发明的大黄鱼脑细胞系的细胞性状优良。为上皮状细胞，呈现出扁平不规则的三角形和多边形等。分裂旺盛，传代时间短，易消化，贴壁率好，耐饥饿；