[发明专利]一种中药中赭曲霉毒素A的适体亲和柱净化新方法

权利要求书

1.一种中药中赭曲霉毒素A的适体亲和柱净化方法，其特征在于：

1)以NHS活 化的sepharose 4FF为载体，OTA适体特异性DNA配基为吸附剂制备适体亲和柱；

OTA 适体亲和柱的制备步骤：

a.OTA适体序列的筛选：合成相关适体DNA序列，考察不同序列对黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂及OTA的特异性，选定OTA特异性序列为5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGG-AGCATCGGACA-3’，选择合适的末端修饰方法-5’端C6间隔臂氨基修饰；

b.适体亲和柱的制备：其步骤主要包括适体复性，洗涤，偶联，封闭，洗涤，装柱；最佳的载体活化方式为NHS，偶联pH值6.0-10.0，偶联时间0-6h；

c.最大吸附量：在最优偶联条件下，制备不同批次适体亲和柱，其最大吸附量高达188.96±10.56ng；

2)以适体亲和柱为净化方法，结合UPLC-FLR技术建立姜粉中OTA的检测方法；

其中，样品提取与净化：称取姜粉20.0g，加入60mL体积比为60∶40的乙腈-水溶液，超声提取15min，定量滤纸粗滤，取5mL滤液加45mL pH范围在5.0-9.0之间的BBS₂，浓度为0.5-2.0倍的BBS₁；

其中BBS₁：10mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl，5mM MgCl₂，pH7.5；

BBS₂：12.5mM Tris，150mM NaCl，6.25mM KCl，6.25mM MgCl₂；

混匀，玻璃纤维滤纸过滤，取AAC柱用1-5mL BBS₁活化，将稀释后的滤液移取3-9mL过柱，用1-5mL BBS₁淋洗，直至空气完全过柱，加入0.5-1.5mL纯甲醇洗脱，将洗脱液用氮气在45℃吹干，最后用体积比为50∶50甲醇-水定容至0.5mL，振荡混匀后，12000rpm下离心5min，取上清液供UPLC测定；

3)以适体亲和柱为净化方法，结合UFLC-MS/MS技术建立中药中OTA的检测方法；

其中，样品提取与净化：取药材粉末2.0g，加入体积比为60∶40，的乙腈-水8mL，2400rpm下涡旋提取2min，静置30min，4000rpm下离心10min，取3mL滤液用BBS₂稀释至30mL，混匀，调节pH至4.5-8.5，玻璃纤维滤纸过滤，取AAC柱用3mL BBS₁活化，将稀释后的滤液取2mL过柱，用1mL BBS₁淋洗，加入1mL纯甲醇洗脱，洗脱液用氮气在45℃吹干，加入浓度为100ng/ml的内标工作液5μL，最后用体积比为50∶50的甲醇-水定容至0.5mL，振荡混匀后，12000rpm下离心15min，取上清液供UFLC-MS/MS测定。

2.根据权利要求1所述中药中赭曲霉毒素A的适体亲和柱净化方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

步骤2)中，适体亲和柱净化-UPLC-FLR检测姜粉中OTA：

a.不同前处理方法及检测技术的对比：对比了QuEChERS、基质辅助固相微萃取、C18萃取小柱、Oasis HLB萃取小柱、Oasis MAX萃取小柱、Mysep 229萃取小柱、Pribofast 290萃取小柱、TC-M160萃取小柱、SPE Ochratoxin A萃取小柱及OchraTestTM免疫亲和柱对样品的净化效果，结果发现只有经免疫亲和柱和适体亲和柱净化后的样品能达到检测的目的，而且UPLC-FLR较HPLC-FLD技术在灵敏度、分析时间方面更具快速、灵敏的检测优势；

b.重复利用性对比：以回收率在70-110％之间为标准，适体亲和柱可达到8次，免疫亲和柱4次；

步骤3)中，适体亲和柱净化-UFLC-MS/MS检测中药中OTA：

a.65种易污染中药材适用性的考察：以20μg/kg的添加水平，考察适体亲和柱在20种种子果实类，20种根及根茎类，6种花类，10种叶及全草类，9种动物类中的适用性，其中种子果实类中药材包括肉豆蔻、胡椒、小茴香、酸枣仁、胖大海、桃仁、陈皮、柏子仁、莲子、使君子、槟榔、生麦芽、决明子、薏苡仁、大枣、白扁豆、杏仁、枳棋子、木瓜和淡豆豉；根及根茎类中药材包括甘草、姜黄、生姜、远志、半夏、郁金、人参、西洋参、当归、葛根、黄芪、黄芩、白芍、天麻、麦冬、板蓝根、石斛、党参、延胡索和巴戟天；花类中药材包括红花、菊花、金银花、槐花、金莲花和辛夷；叶及全草类中药材包括淡竹叶、荷叶、桑叶、侧柏叶、银杏叶、薄荷、广藿香、芫荽、益母草和青蒿；动物类中药材包括龟板、蜈蚣、水蛭、全蝎、僵蚕、地龙、乌梢蛇、土鳖虫和鸡内金。