[发明专利]一种中药中赭曲霉毒素A的适体亲和柱净化新方法

说明书

本发明涉及一种以NHS活化的sephrose4FF为载体，赭曲霉毒素A特异性适体为配基制备的具有操作简单，偶联速度快，偶联效率高的适体亲和柱的制备方法。经系统考察后，该亲和柱在中药中适用性良好，能起到快速净化中药中赭曲霉毒素A的目的，且所建立的检测方法准确度好，灵敏度高，可用于中药中赭曲霉毒素A的快速筛查。此外，该适体亲和柱制备方法简便易行，生产成本较低，质量稳定可控，能满足中药中赭曲霉毒素A的快速检测，具有广阔的开发前景。

技术领域

本发明涉及一种中药中赭曲霉毒素A的净化新方法，特别是涉及适体亲和柱(AAC)的制备，AAC净化超高效液相荧光检测及液质联用检测中药中赭曲霉毒素A，其属于真菌毒素检测领域。

背景技术

赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)是异香豆素联结L-苯丙氨酸的衍生物，由曲霉菌属和青霉菌属等产毒菌株产生的二级代谢产物，具有很强的肝肾毒性、神经毒性及免疫毒性等，故1993年国际癌症组织IARC已将其定义为2B类致癌物。OTA在全球污染范围较广，其广泛存在于各类食品及农作物中，且污染水平较高。近年来，一些诸如甘草、生姜、姜黄等中草药及其制品也被发现污染OTA，且污染状况不容小觑。但由于中药材种类繁多、基质复杂、加工和储藏尚存在不当之处加之OTA痕量(ppb)、pH敏感性等特点，实际检测困难重重。故目前除了欧盟(EU)对甘草和芳香植物做了相关的OTA限量规定外，其他国家尚处于摸索阶段，特别是我国相关组织对中药材OTA的限量还是空白。因而寻找一种简单、快速、准确、经济、特异性的前处理方法，消除中药基质干扰，对于研究中药中OTA的污染状况，制定中药中OTA的限量标准具有重要意义。

适体(aptamer)是通过指数富集配基系统进化技术(SELEX)体外筛选得到的一类与目标分子高特异性结合的寡聚核苷酸片段。作为靶物质识别元件，与抗体相比aptamer具有多重优势，如其合成往往可通过体外化学合成，而抗体则需在一定的生理条件下，故aptamer受环境的影响较小，易于修饰，且制备更为经济，此外aptamer对结构类似物的识别能力更强，可达到nM级别，而抗体往往存在交叉反应。因此其作为一个优于抗体的新型识别配基，已在食品快速检验、环境检测、临床诊断和治疗以及毒理研究等领域展示了良好的应用前景。

发明内容

本发明旨在提供一种制备方法简单、偶联速度快、偶联效率高、净化效果好可有效排除中药基质的干扰的AAC的制备方法，其优点在于以适体为特异性配基，NHS活化的sepharose4FF为载体，将这两者的优势联合起来，起到高效偶联，快速净化的目的，操作简单，价格低廉，能够应用于不同中药部位，消除不同中药成分的干扰，具有广阔的开发前景。

技术解决方案

本发明采用的技术方案是：优选、合成和末端修饰OTA适体序列，再在一定条件下混合NHS活化的sephrose 4FF，偶联上适体，制备出AAC；再以易污染真菌毒素的不同中药部位，不同次生代谢产物考察对柱效的影响；最后联合使用UPLC-FLR，UFLC-MS/MS等分析仪器建立AAC净化中药中OTA的检测方法。

技术路线图见图1

技术要点：

(1)AAC的制备方法，按照下述步骤进行：

a.OTA适体序列的筛选：查阅文献，合成相关适体DNA序列，考察不同序列的特异性，Apt-2对黄曲霉毒素B₁，B₂的吸附性较好，对黄曲霉毒素G₁，G₂及OTA也有一定的吸附，故特异性不强，因此优先OTA特异性序列为Apt-1(5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGG-AGCATCGGACA-3’)，选择合适的末端修饰方法-5’端C6间隔臂氨基修饰；

OTA适体特异性图见图2