[发明专利]一种高产恩拉霉素菌株及其筛选方法

权利要求书

1.一种高产恩拉霉素的菌株，其特征在于：分类名称为杀真菌链霉菌（Streptomyces fungicidicus）DCS069，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编号为CGMCC No.6216，保藏日期是2012年6月14日。

2.根据权利要求1所述的一种高产恩拉霉素的菌株，其特征在于：该菌株单菌落为白色，边缘整齐，孢子丰满。

3.一种筛选高产恩拉霉素菌株的方法，包括以下步骤：

A、试管斜面培养：砂土管保藏的出发株转接试管斜面，温度28.0±0.5℃，湿度40%-60%恒温室培养5-8天；

B、菌丝培养：将成熟的斜面接种于DC-S菌丝培养基中，28.0±0.5℃，220rpm，培养40-50h，然后转接于含有0.2-1.0%甘氨酸的DC-S菌丝培养基中，28.0±0.5℃，220rpm，培养35-45h；

C、原生质体制备：将制备得到的菌丝体在3000rpm离心10min，弃上清，收集菌丝体；用高渗缓冲液洗涤2次，加入终浓度为1-2mg/mL的溶菌酶，混合均匀，30℃保温30-120min，过程中不断振荡混匀；然后用含有棉花的枪头过滤酶解液，除去残留菌丝体，收集滤液；在1000rpm转速下离心5min，温和的沉淀原生质体；再用高渗缓冲液洗涤原生质体一次，以洗净酶液；弃去上清液，然后用适量高渗缓冲液重新悬浮原生质体；

D、原生质体微波处理：将制备好的原生质体悬液，转移至灭菌的培养皿中，置于微波炉内进行微波处理；

E、原生质体再生培养：经微波处理的原生质体进行稀释、分离，稀释度为10^-4-10^-7个/mL，稀释液平铺在R2YE再生培养基上，于28.0±0.5℃，40%-60%湿度条件下培养5-8天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养；

F、菌株初筛：在再生培养基上挑取单菌落接种到斜面培养基上，于28.0±0.5℃，40%-60%湿度条件下培养5-8天；斜面成熟后接种到种子培养基中，于28.0±0.5℃，220rpm震荡培养26-30h；种液成熟后接种到发酵培养基中，相同条件下震荡培养9-12天，生长到周期后检测效价，选效价高的菌株进行砂土保藏；

G、菌株复试：取初筛保藏的菌株转接试管斜面，于28.0±0.5℃，40%-60%湿度条件下培养5-8天，斜面成熟转接至种子培养基中，于28.0±0.5℃，220rpm震荡培养26-30h，种液成熟后转接至发酵培养基中，于相同条件下震荡培养9-12天，取样检测效价，筛选保留效价高的菌株为杀真菌链霉菌（Streptomyces fungicidicus）DCS069。

4.根据权利要求3所述的一种筛选高产恩拉霉素菌株的方法，其特征在于：所述的步骤B中所用的DC-S菌丝培养基中成分及其含量为：0.5%葡萄糖，0.8%麦芽糖粉，0.4%蛋白胨，0.4%酵母粉，0.05%MgSO₄·7H₂O，0.2%KH₂PO₄，0.4%K₂HPO₄，0.3%氯化钠。

5.根据权利要求3所述的一种筛选高产恩拉霉素菌株的方法，其特征在于：所述的步骤D中微波处理条件为：调整微波炉功率为700W，脉冲频率为2450Hz，对原生质体悬液进行辐照处理10s，取出冰上放置20s，反复进行以上步骤，至累计微波处理时间60-120s。