[发明专利]一种高产恩拉霉素菌株及其筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及工业生物技术、微生物菌种筛选技术领域，尤其是一种高产恩拉霉素菌株及其筛选方法。 

背景技术

恩拉霉素（Enramycin），又名安来霉素、恩来霉素、恩霉素、持久霉素，是由放线菌Streptomyces fungicidious发酵产生的一种由不饱和脂肪酸和十几种氨基酸组成的环状多肽类抗生素。最早由日本武田药品工业株式会社研发，1974年在日本正式注册。1993年，我国农业部批准该药在我国注册。2009年，其在中国的销售额达到2亿元人民币。 

恩拉霉素作为一种新型肽类抗生素，其抗菌作用机理是抑制细菌细胞壁的合成。由于只需要添加微量恩拉霉素就可以呈现出优良的促生长和改善饲料利用率的作用，并且具有稳定性、低毒性、长期使用后不易产生耐药性等特点，因此被世界上很多国家推荐作为动物促生长剂，是一种较好的饲料添加剂。因此，对恩拉霉素高产菌株的选育和研究具有很好的经济效益和社会效益。 

发明内容

本发明的目的是提供一种高产恩拉霉素菌株及其筛选方法。 

为了完成上述目的，本发明采用的技术方案是： 

一种高产恩拉霉素的菌株，分类名称为杀真菌链霉菌（Streptomyces fungicidicus）DCS069，保藏在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.6216，保藏日期是2012年6月14日。 

该菌株单菌落为白色，边缘整齐，孢子丰满。 

一种筛选高产恩拉霉素菌株的方法，包括以下步骤： 

A、试管斜面培养：砂土管保藏的出发株转接试管斜面，温度28.0±0.5℃，湿度40%-60%恒温室培养5-8天； 

B、菌丝培养：将成熟的斜面接种于DC-S菌丝培养基中，28.0±0.5℃，220rpm，培养40-50h，然后转接于含有0.2-1.0%甘氨酸的DC-S菌丝培养基中，28.0±0.5℃，220rpm，培养35-45h； 

C、原生质体制备：将制备得到的菌丝体在3000rpm离心10min，弃上清，收集菌丝体；用高渗缓冲液洗涤2次，加入终浓度为1-2mg/mL的溶菌酶，混合均匀，30℃保温30-120min，过程中不断振荡混匀；然后用含有棉花的枪头过滤酶解液，除去残留菌丝体，收集滤液；在1000rpm转速下离心5min，温和的沉淀原生质体；再用高渗缓冲液洗涤原生质体一次，以洗净酶液；弃去上清液，然后用适量高渗缓冲液重新悬浮原生质体； 

D、原生质体微波处理：将制备好的原生质体悬液，转移至灭菌的培养皿中，置于微波炉内进行微波处理； 

E、原生质体再生培养：经微波处理的原生质体进行稀释、分离，稀释度为10^-4-10^-7个/mL，稀释液平铺在R2YE再生培养基上，于28.0±0.5℃，40%-60%湿度条件下培养5-8天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养； 

F、菌株初筛：在再生培养基上挑取单菌落接种到斜面培养基上，于28.0±0.5℃，40%-60%湿度条件下培养5-8天；斜面成熟后接种到种子培养基中，于28.0±0.5℃，220rpm震荡培养26-30h；种液成熟后接种到发酵培养基中，相同条件下震荡培养9-12天，生长到周期后检测效价，选效价高的菌株进行砂土保藏； 

G、菌株复试：取初筛保藏的菌株转接试管斜面，于28.0±0.5℃，40%-60%湿度条件下培养5-8天，斜面成熟转接至种子培养基中，于28.0±0.5℃，220rpm震荡培养26-30h，种液成熟后转接至发酵培养基中，于相同条件下震荡培养9-12天，取样检测效价，筛选保留效价高的菌株为杀真菌链霉菌（Streptomyces fungicidicus）DCS069。 

所述的步骤B中所用的DC-S菌丝培养基中成分及其含量为：0.5%葡萄糖，0.8%麦芽糖粉，0.4%蛋白胨，0.4%酵母粉，0.05%MgSO₄·7H₂O，0.2%KH₂PO₄，0.4%K₂HPO₄，0.3%氯化钠。 

所述的步骤D中微波处理条件为：调整微波炉功率为700W，脉冲频率为2450Hz，对原生质体悬液进行辐照处理10s，取出冰上放置20s，反复进行以上步骤，至累计微波处理时间60-120s。