[发明专利]重组质粒、利用该重组质粒制备的重组杆状病毒以及该病毒在疫苗制备中的应用

权利要求书

1.一种重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM，其特征在于：由一段重组序列插入到pFastBacDual质粒中构建而成，所述重组序列为根据CMV、Pph、SP、TM已知序列，在SP和TM核苷酸序列间加入Xba I酶切位点和Xho I酶切位点，CMV-F前加入KpnI酶切位点，TM-R后加入HindIII酶切位点形成，所述重组序列全长为923bp，如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM，其特征在于：所述重组序列具体插入到pFastBacDual质粒的KpnI酶切位点和HindIII酶切位点之间。

3.利用权利要求1所述的重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM构建的重组杆状病毒BmPvs25，其特征在于：由间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因插入到重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到表面展示有间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒。

4.根据权利要求3所述的重组杆状病毒BmPvs25，其特征在于：所述Pvs25基因具体插入到重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM的Xba I酶切位点和Xho I酶切位点之间。

5.根据权利要求3所述的重组杆状病毒BmPvs25，其特征在于：所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。

6.权利要求3-5任一权利要求所述的重组杆状病毒BmPvs25的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）通过PCR扩增的方法得到间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因，然后将Pvs25基因连接到重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM的Xba I酶切位点和Xho I酶切位点之间，得到重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-Pvs25-TM；

（2）将重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-Pvs25-TM转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40-48h后挑取白斑，白斑继续培养24-48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定；

（3）取步骤（2）鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为表面展示间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25。

7.权利要求3-5任一权利要求所述的重组杆状病毒BmPvs25所表达的融合蛋白SP-Pvs25-TM，其特征在于：由间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的N端接gp64分泌性信号肽（SP）、C端接gp64跨膜结构域（TM）构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

8.权利要求3-5任一权利要求所述的重组杆状病毒BmPvs25在间日疟传播阻断疫苗制备中的应用。

9.权利要求7所述的融合蛋白SP-Pvs25-TM在间日疟传播阻断疫苗制备中的应用。