[发明专利]重组质粒、利用该重组质粒制备的重组杆状病毒以及该病毒在疫苗制备中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种经改造的杆状病毒质粒即重组质粒，利用该重组质粒制备的含目的基因（间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因）的重组杆状病毒，该重组杆状病毒的制备方法，该重组杆状病毒表达的融合蛋白，以及该重组杆状病毒和该融合蛋白在间日疟传播阻断疫苗制备中的应用。 

背景技术

间日疟是由间日疟原虫引起的周期性发作的急性传染病，特点是间隔48小时反复发作。如今面世的集中抗疟疾药物也由于抗药性疟原虫以及耐杀虫剂传播蚊的出现而面临挑战。制备疟疾疫苗也就成为了能有效控制疟疾传播的主要手段。其中传播阻断疫苗是以蚊阶段疟原虫特异表达的虫体表面蛋白作为抗原免疫人体，使之产生抗蚊阶段疟原虫表面蛋白的特异性抗体。间日疟传播阻断候选抗原Pvs25是疟疾研究的主要靶点，其在不同地区的疟疾病毒株间具有很高的保守性。 

现在的生物技术常用的生物体是各种种类的酵母菌核大肠杆菌，但是通过大肠杆菌表达出来的Pvs25蛋白在传播阻断实验中并没有检测到有明显的免疫原性和免疫保护性，而用酵母其中的毕赤酵母表达的Pvs25蛋白可以有很好的表达，得到的抗体也可以检测到免疫原性和保护性，而且已经进入了临床I期，但是在进入下一期临床的时候，人体产生了排斥反应。现如今表达的哺乳动物表达系统可以看到效果，但是表达量很低，成本相对较高，不满足大量生产需要。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种重组杆状病毒质粒，利用该重组质粒构建表面展示间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒，通过简单地分离纯化病毒粒子，制备抗体具有良好的抗体效价，能够为间日疟传播阻断疫苗的研究提供参考。在家蚕BmN细胞中传代培养细胞获得F3代病毒，以此F3代病毒接种家蚕BmN，从细胞中分离纯化获得病毒粒子，其可以直接作为疫苗，免疫Balb/c小鼠，间接ELISA检测抗体效价能达到1:25600。此种方法相比较原核的和其他的真核表达系统生产疫苗的方法具有安全性好、生产成本低、易于大规模生产操作的特点。 

本发明所采用的技术方案为： 

一种重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM，该重组质粒由一段重组序列插入到pFastBacDual质粒中构建而成，所述重组序列为根据CMV、Pph、SP、TM已知序列，在SP和TM核苷酸序列间加入Xba I酶切位点和Xho I酶切位点，CMV-F前加入KpnI酶切位点，TM-R后加入HindIII酶切位点形成，所述重组序列全长为923bp，如SEQ ID NO：1所示。 

具体地，所述重组序列插入到pFastBacDual质粒的KpnI酶切位点和HindIII酶切位点之间。 

本发明进一步提供利用上述重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM构建的重组杆状病毒BmPvs25，该重组杆状病毒由间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因插入到重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到表面展示有间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒。 

具体地，所述Pvs25基因插入到重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM的Xba I酶切位点和Xho I酶切位点之间。 

具体地，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。 

穿梭载体Bacmid（即Baculovirusplasmid）为带有杆状病毒基因组的质粒，可在细菌和昆虫细胞之间穿梭，是Bac-to-bac杆状病毒表达系统的成员之一，该系统还包括供体质粒和辅助质粒及大肠杆菌，为现有技术。 

载体pFastBacDual是Bac-to-bac表达系统的供体质粒，可以插入外源基因并在辅助质粒编码的转座酶作用下，将外源基因插入到Bacmid中。载体pFastBacDual已经商品化；CMV启动子为哺乳动物启动子，将其插入杆状病毒后，杆状病毒可以在哺乳动物里表达外源基因。 

上述重组杆状病毒BmPvs25的制备方法，包括以下步骤： 

（1）通过PCR扩增的方法得到间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因，然后将Pvs25基因连接到重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM的Xba I酶切位点和Xho I酶切位点之间，得到重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-Pvs25-TM；