[发明专利]海水养殖中5种弧菌的NASBA-微孔板检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.海水养殖中5种弧菌的NASBA-微孔板检测试剂盒，该NASBA-微孔板试剂盒包括酶混合液和含正义引物、反义引物的反应液，其特征在于还包括5种探针溶液，所述正义引物为引物gyrB-R，所述反义引物为引物gyrB-F1和引物gyrB-F2，所述5种探针溶液分别为含有生物素标记的探针Vpa-probe的副溶血弧菌探针溶液，含有生物素标记的探针Val-probe的溶藻弧菌探针溶液，含有生物素标记的探针Vha-probe的哈维氏弧菌探针溶液，含有生物素标记的探针Vvu-probe的创伤弧菌探针溶液，含有生物素标记的探针Van-probe的鳗弧菌探针溶液，各引物和探针的核苷酸序列分别如下：

引物gyrB-R：AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGA GTCATGATGA TGATGTTGTG；

引物gyrB-F1：GACTGTCAGG AAAAAGATCC；

引物gyrB-F2：CGTGAAGCGG CGCGTAAAGC；

探针Vpa-probe：CAGCTAAGCA GGGTCGTAAT；

探针Val-probe：GTACAACCCG GACAAGCTTC；

探针Vha-probe：GCTATCTTCT CAAGAAGTAG C；

探针Vvu-probe：CTGATCACTG CACTAGGTTG；

探针Van-probe：AAAACCAAGC GATTTTGCCA。

2.如权利要求1所述的海水养殖中5种弧菌的NASBA-微孔板检测试剂盒，其特征在于所述酶混合液含有浓度为8U的禽源成髓细胞瘤逆转录酶，浓度为0.08U的核糖核酸酶H，浓度为40U的T7RNA聚合酶；所述反应液含有浓度为0.7mM的脱氧核糖核苷酸，浓度为12U的核糖核苷酸，浓度为0.91mM的三磷酸尿苷,浓度为1mM的三磷酸腺苷,浓度为1mM的三磷酸胞苷,浓度为1mM的三磷酸鸟苷,浓度为0.09mM的地高辛标记的三磷酸尿苷,浓度为10mM的KCl,浓度为40mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸,浓度为12mM的MgCl2,浓度为0.1μg/μL的牛血清白蛋白,体积百分浓度为5%的二甲基亚砜,浓度为5mM的二硫苏糖醇，浓度都为0.2mM的引物gyrB-R、引物gyrB-F1和和引物gyrB-F2；所述副溶血弧菌探针溶液中探针Vpa-probe的浓度为0.1μM，所述溶藻弧菌探针溶液中探针Val-probe的浓度为0.1μM，所述哈维氏弧菌探针溶液中探针Vha-probe的浓度为0.1μM，所述创伤弧菌探针溶液中探针Vvu-probe的浓度为0.1μM，所述鳗弧菌探针溶液中探针Van-probe的浓度为0.1μM。

3.利用权利要求1所述的海水养殖中5种弧菌的NASBA-微孔板检测试剂盒检测海水养殖中弧菌的方法，其特征在于步骤如下：

a、取细菌培养液，加入RNAiso试剂抽提总RNA，得到RNA模板，具体依RNAiso试剂说明书操作；

b、取上述RNA模式5μL，加入所述反应液32.5μL，65℃下温育5min，再加入所述酶混合液12.5μl，42℃下反应1h，得到NASBA扩增产物；

c、用pH7.2、含有体积百分浓度0.05%的吐温20的磷酸缓冲液清洗链霉亲合素酶标板的微孔3次，每孔每次300μL，清洗完毕后各孔分别加入100μL的所述副溶血弧菌探针溶液，溶藻弧菌探针溶液，哈维氏弧菌探针溶液，创伤弧菌探针溶液，鳗弧菌探针溶液，室温下轻柔振荡孵育1h，吸干微孔中液体，再用pH7.2、含有体积百分浓度0.05%的吐温20的磷酸缓冲液清洗微孔3次，每次每孔300μL，得到包被探针的微孔；

d、取10μL NASBA扩增产物，在65℃下孵育5min，加入pH7.0、浓度为50mM的磷酸缓冲液90μL混匀，然后加入到包被探针的微孔中，37℃下孵育1h，吸干微孔中液体，用杂交洗液清洗微孔3次，拍干，每微孔加200μL封闭液室温下封闭孵育30min，所述杂交洗液含有浓度0.0015mol/L的柠檬酸钠,浓度0.015mol/L的NaCl,质量百分浓度0.1%的十二烷基磺酸钠，所述封闭液为含有体积百分浓度0.05%的吐温20，质量百分浓度1%的牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；

e、封闭孵育30min后，微孔中加入100倍稀释的碱性磷酸酶标记生物素抗体100μL，室温下孵育30min，再加入氯化硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐100μL，37℃下避光显色15min，加入硫酸中止反应，在酶标仪上测定包被探针的微孔A405nm的吸收值。