[发明专利]海水养殖中5种弧菌的NASBA-微孔板检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病原性弧菌的检测技术，具体涉及海水养殖中5种弧菌的NASBA-微孔板检测试剂盒及检测方法。

背景技术

随着海水养殖业的迅速发展，病害问题日益显露，常年发病率达50%以上，损失率20%左右，每年因此造成的直接经济损失高达百亿元之巨，并且呈上升趋势。目前我国海水养殖病害发生的主要特点是：发病的海水养殖品种多，如鱼类、甲壳类、贝类等养殖品种；疾病种类多、变异快，如鱼类的皮肤溃疡病、肠炎病、烂尾病、烂鳃病、柱状屈挠杆菌病和类结节病等，甲壳类的红腿病、细菌性幼体败血症、黑鳃综合症、瞎眼病、甲壳溃疡病、肠道溃疡病、屈挠杆菌病、烂鳃病、罗氏沼虾黑斑病和丝状细菌病等，贝类的气单胞菌病和弧菌病等；疾病流行的速度加快，区域扩大，危害增加；多病原综合发病普遍，并发、继发性疾病常见。其中细菌性病原包括溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、哈维氏弧菌（V.harveyi）、霍乱弧菌（V.cholerae）、创伤弧菌（V.vulnificus）、鳗利斯顿氏菌（Listonella anguillarum）、杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）、美人鱼发光杆菌（Photobacterium damsela）、迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）和柱状屈桡杆菌（Flexibacter columnaris）等。目前病原性弧菌的检测有PCR、ELISA(酶联免疫吸附)、LAMP和基因芯片等，如公开号为CN1012025557的发明专利申请，就通过三重PCR引物检测溶藻弧菌；公开号为CN101020926的发明专利申请，就通过LAMP技术检测霍乱弧菌；公告号为CN101178363的发明专利就以引物和探针恒温扩增、酶联检测副溶血弧菌；但ELISA具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，缺点也较明显，它的实验周期较长，一般需要1-2天时间，且特异性的单克隆抗体制备比较困难，同时它检测的是蛋白，所以对于细菌检测来说，无法判断目标菌是死菌还是活菌，容易产生错误。RT-PCR快速、敏感、特异，它是实时、在线地检测PCR扩增过程而无需对PCR扩增产物进行后处理，克服了常规PCR技术易污染的缺点，然而RT-PCR需要昂贵的仪器设备，对技术人员的操作要求高，不适合基层使用。LAMP恒温扩增、极其快速，但同样有缺点，如引物的设计麻烦、反应体系不稳定、不能进行多重扩增。基因芯片可实现通过一次实验操作得出多种病原菌准确的鉴定结果，满足对复杂样品中多种共存背景细菌平行性检测的要求，但需要昂贵的专业仪器设备，且目前检测费用极为昂贵，一般实验室尚无法配置，更不用说在基层推广应用。

核酸序列依赖性扩增技术（Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA）是一项以RNA为模板的快速等温扩增技术，NASBA扩增体系包括酶混合液和反应液（含有正义引物、反义引物、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸等），酶混合液中含有禽源成髓细胞瘤逆转录酶（AMV-RT）、核糖核酸酶H（RNase H）和T₇RNA聚合酶，正义引物（Sense primer）长约45个核苷酸，其5'-端带有可被T₇RNA聚合酶识别的启动子序列，其3'-端与模板RNA的3'-末端序列互补；反义引物（Antisense primer）长约20个核苷酸，与模板RNA的5'-末端序列一致。扩增反应主要在AMV-RT、RNase H和T₇RNA聚合酶的三种酶的共同作用下，以单链RNA为模板，进行核苷酸序列的扩增，它不仅具有比常规PCR等技术更高的灵敏度、准确度，而且操作方便，不需要特殊的控温装置，特别适用于现场快速检测。目前，该技术已广泛应用于病原体、基因异常的检测、肿瘤的诊断和监控、疾病易发性检测、食品的监测、兽疾诊断、水质监控和法医学等领域。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测灵敏、特异，操作方便，可现场快速检测海水养殖中5种弧菌的NASBA-微孔板检测试剂盒及检测方法。